本文選題：磁共振擴散張量成像　切入點：交叉性小腦神經(jīng)機能聯(lián)系不能　出處：《鄭州大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：缺血性腦梗死是威脅我國人類健康的常見疾病,是較為嚴重的缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease,ICVD)其中之一,其特點為高發(fā)病率、高死亡率以及高致殘率,部分預后不佳,一旦罹患,勢必會為社會及家庭、個人造成負擔。因此,越來越多的臨床學者聚焦于腦梗死的預后改善及神經(jīng)功能恢復的研究。隨著相關研究的增多,人們發(fā)現(xiàn),腦梗死后不僅原發(fā)病灶區(qū)域可出現(xiàn)相應的病理生理學改變,其遠隔部位如對側大腦半球和雙側小腦亦可出現(xiàn)繼發(fā)性的功能及代謝障礙,而這一現(xiàn)象可能在神經(jīng)功能恢復中起著重要作用,其發(fā)生機制與神經(jīng)機能聯(lián)系不能學說有關。神經(jīng)機能聯(lián)系不能(diaschisis),這個名詞提出于上個世紀初,即局限于幕上的腦組織損傷可造成與它有纖維聯(lián)系的其他區(qū)域的功能改變。隨著人們對此現(xiàn)象了解的進一步深入以及先進檢查手段的運用,對神經(jīng)機能聯(lián)系不能的發(fā)生發(fā)展機制及對于其臨床意義的認識都取得了極大的進展,對臨床診斷及治療均起到一定的指導意義,在腦梗死患者的康復過程中亦起到了一定影響。擴散張量成像(diffusion tensor imaging,DTI)是一種用于描述水分子擴散方向特征的磁共振技術,它可以通過計算水分子的彌散程度和彌散方向間接的評價大腦白質纖維的完整性。DTI不只反映水分子擴散受限的整體情況,還反映水分子擴散受限的方向性,是目前唯一一種能有效觀察和追蹤腦白質纖維束的非侵入性檢測方法。RGMa蛋白(Repulsive guidance molecule,A)在中樞神經(jīng)生長發(fā)育的過程中起著重要作用,其介導排斥性軸突導向信號以及神經(jīng)管的閉合,參與神經(jīng)元細胞的生長、增殖和分化,參與了腦梗死后神經(jīng)元及軸突的修復與再生。本實驗擬運用RNAi技術,構建重組腺病毒為載體的r Ad5-sh RNA-RGMa,對大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠模型缺血區(qū)域大腦皮質、基底節(jié)區(qū)進行基因沉默,觀察該特異性干預手段對急性局灶性缺血大鼠腦組織RGMa表達水平、軸突生長/再生情況以及神經(jīng)功能恢復的影響,結合磁共振擴散加權成像檢查,進一步闡明RGMa在中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生抑制因子中的重要地位,探討交叉性小腦神經(jīng)機能聯(lián)系不能(crossed cerebellar diaschisis,CCD)的發(fā)生機制,為臨床腦缺血及CCD的監(jiān)測評估和治療尋找有效靶點,為腦缺血后促進神經(jīng)功能恢復提供依據(jù)并奠定基礎。本文分為以下三個部分。第一部分RGMa在MCAO大鼠腦組織的表達及與軸突再生的關系目的觀察急性局灶性腦缺血損傷大鼠腦組織中RGMa表達水平、軸突生長/再生情況以及對神經(jīng)功能恢復的影響,結合磁共振擴散加權成像及相關參數(shù)的量化評價,為CCD現(xiàn)象的發(fā)生發(fā)展機制提供實驗基礎和理論依據(jù),為下一步實驗打下基礎。方法建立大鼠MCAO模型,將模型組隨機分為12h、24h、48h、7d、10d組,與對照組一起分別于相應時間點行MRI掃描,測量ADC值和FA值。掃描后取腦組織,RT-PCR方法檢測RGMa和Rho A m RNA的表達情況,免疫組化法檢測RGMa、Rho A蛋白、軸突再生情況,TUNEL法檢測細胞凋亡情況,電子顯微鏡觀察細胞超微結構變化。結果模型組大鼠梗死側核心區(qū)及雙側小腦ADC值和FA值較正常組降低,12h降至最低,梗死對側小腦降低較同側小腦更為顯著(P0.05)。術后12h起可見RGMa陽性細胞表達并持續(xù)增加,48h表達達高峰,雙側小腦半球RGMa蛋白表達較之對照組均顯著升高(P0.05),以右側小腦為著。RGMa蛋白表達與磁共振參數(shù)及軸突生長情況呈顯著負相關。結論與正常組相比,大鼠腦梗死后雙側小腦的影像學參數(shù)及病理學指標的變化均有統(tǒng)計學意義,且右側較左側為著,說明腦梗死后CCD現(xiàn)象存在。RGMa蛋白參與軸突的再生與重塑,間接說明磁共振參數(shù)變化及與CCD現(xiàn)象的關聯(lián)機制,為后續(xù)實驗打下基礎。第二部分RGMa特異性RNAi重組腺病毒的構建目的構建靶向Rat RGMa基因sh RNA腺病毒載體以及完成病毒載體的包裝,為下一步實驗做準備。方法設計3條靶序列sh RNA進行篩選,設計并合成編碼短發(fā)夾RNA(sh RNA)序列的DNA單鏈,退火鏈接,稀釋備用。構建RGMa特異性RNAi腺病毒載體,酶切、測序鑒定后轉染PC12細胞進行最佳干擾片段的篩選。反轉錄-聚合酶鏈反應檢測重組腺病毒r Ad5-sh RNA-RGMa轉染PC12細胞后RGMa m RNA的轉錄抑制情況及重組腺病毒r Ad5-sh RNA-RGMa轉染PC12細胞后的轉染效率,篩選出最佳干擾片段。結果設計的3條si RNA中,Adv-si R1的轉染效率最高,測定其滴度為2.5×109Pfu/ml,用于下部分實驗。Adv(-)的測定滴度為2.1×109Pfu/ml,用于陰性對照。結論成功構建靶向Rat RGMa基因的sh RNA腺病毒載體,轉染效果穩(wěn)定有效,可用于下部分實驗。第三部分RGMa特異性RNAi轉染后MCAO大鼠RGMa表達及MR成像目的采取基因沉默技術,特異性沉默MCAO大鼠腦皮質及基底節(jié)RGMa蛋白的表達,觀察其對缺血側腦組織及其遠隔部位RGMa表達水平和軸突再生以及大鼠神經(jīng)功能的影響,為缺血性腦梗死及CCD的治療提供新的視角。方法建立大鼠MCAO模型,隨機分為模型2d組,空白對照2d組,陰性對照2d組,RNAi干預2d組,分別于相應時間點行磁共振檢查,每組4只應用western blotting方法檢測RGMa蛋白的表達情況,8只應用免疫組化法檢測RGMa蛋白及軸突再生情況。結果與模型組相比,干預組梗死核心區(qū)即左側基底節(jié)區(qū)ADC值及FA值有所升高,RGMa蛋白表達降低(P0.05),陰性對照組和空白對照組與模型組相比無明顯變化。雙側小腦ADC值及FA值、RGMa蛋白表達4組無差異。結論給予RGMa特異性RNAi重組腺病毒Adv-sh RNA-RGMa行干預治療后,大鼠幕上腦組織RGMa表達降低,磁共振參數(shù)升高,說明該方法對于腦梗死的治療有效,為臨床腦梗死的治療提供了新的靶點及無創(chuàng)性監(jiān)測手段。
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【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R743.3

【參考文獻】

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1 劉佳;沈加林;許建榮;董青;周滟;路青;;磁共振彌散張量成像在特發(fā)性震顫中的應用[J];醫(yī)學影像學雜志;2009年02期

2 吳兆蘇,姚崇華,趙冬;我國人群腦卒中發(fā)病率、死亡率的流行病學研究[J];中華流行病學雜志;2003年03期

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本文編號：1595119