本文選題：Notch2　切入點(diǎn)：膠質(zhì)瘤　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤,具有較強(qiáng)的侵襲性和進(jìn)展性。目前臨床治療上采用的主要方法有手術(shù)切除、放療及化療的綜合療法,但由于膠質(zhì)瘤的生長特性,與周圍腦組織界限不清,手術(shù)難以切除完全,而放療、化療由于膠質(zhì)瘤對(duì)其耐受性等治療的局限性,療效有限,患者中位生存期較短,尤其對(duì)于高級(jí)別膠質(zhì)瘤,治療后復(fù)發(fā)率較高,預(yù)后差,中位生存期不足一年,病死率高,嚴(yán)重威脅患者生命影響人類健康。研究其發(fā)病機(jī)制,尋找新的有效的治療方法是臨床研究的主要目標(biāo)之一。細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程密切相關(guān),在膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展過程中,存在著很多信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng),復(fù)雜而精細(xì)調(diào)控機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡,癌基因及抑癌基因?qū)?xì)胞周期及細(xì)胞凋亡通路調(diào)節(jié)的失控,信號(hào)通路傳導(dǎo)系統(tǒng)異常刺激腫瘤細(xì)胞增殖與進(jìn)展,發(fā)生細(xì)胞癌變。在分子水平上的免疫治療和基因治療是近年來膠質(zhì)瘤治療研究的新方向,通過抑制異常激活的信號(hào)傳導(dǎo)通路,調(diào)控細(xì)胞周期,是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤細(xì)胞增殖的有效措施之一 Notch信號(hào)通路是在無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中普遍存在的,在進(jìn)化上具有高度的保守性的信號(hào)傳導(dǎo)通路,在細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育中具有重要的關(guān)鍵性作用。Notch信號(hào)通路與惡性腫瘤的關(guān)系已成為近年來的研究熱點(diǎn)之一,其與腫瘤通路有較多的相互作用,Notch受體和配體在多種腫瘤中表現(xiàn)為異常表達(dá),與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。且在不同類型的腫瘤中,甚至在同一腫瘤的不同發(fā)展階段,Notch表達(dá)的作用也不盡相同,可表現(xiàn)為致癌性,也可表現(xiàn)為抑癌性。Notch受體包括Notchl-4種,研究顯示,每種受體在腫瘤中的生物學(xué)功能有所不同,甚至截然相反,因此,有必要對(duì)每種Notch受體分別進(jìn)行研究。關(guān)于Notch信號(hào)與腫瘤生成的因果關(guān)系尚無定論,在腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路異常,尋找到可能的靶點(diǎn),通過體外試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等方法,靶向研究Notch信號(hào)通路異常對(duì)腫瘤生成的影響,探討Notch信號(hào)通路和腫瘤生成的作用機(jī)制,以期對(duì)腫瘤診斷和治療提供新的思路和方法,是研究的常用模式。 RNA干擾技術(shù)是研究基因功能的有效手段,有利于迅速的發(fā)現(xiàn)藥物作用的有效靶點(diǎn),并通過體外細(xì)胞培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)來得以證實(shí)。短發(fā)夾狀RNA (shRNA)是設(shè)計(jì)為能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的非編碼小分子RNA,可被細(xì)胞核內(nèi)自身基因表達(dá)序列表達(dá),可以通過內(nèi)源性的RNA干擾來抑制特定基因的表達(dá),可使靶向基因長時(shí)間穩(wěn)定沉默。質(zhì)粒載體是shRNA主要載體之一,能使目的shRNA穿過生理屏障,并在細(xì)胞核內(nèi)完成自我復(fù)制發(fā)揮穩(wěn)定持久的干擾效果。以質(zhì)粒構(gòu)建shRNA并轉(zhuǎn)染細(xì)胞是腫瘤分子水平研究的重要手段之一。裸鼠是先天性胸腺缺陷的突變小鼠,是腫瘤學(xué)研究中常用的動(dòng)物模型,其免疫缺失和便于觀察等特點(diǎn),使其在腫瘤研究中被廣泛應(yīng)用。 近年來研究發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)在人類腦膠質(zhì)瘤中也發(fā)揮作用,但Notch信號(hào)在膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展中的具體作用尚不明確。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化方法對(duì)32例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本和20例腦組織標(biāo)本進(jìn)行Notch2蛋白的檢測,研究Notch2在人類腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義。并構(gòu)建Notch2-shRNA干擾質(zhì)粒對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251進(jìn)行轉(zhuǎn)染,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株,利用實(shí)時(shí)定量PCR、蛋白印跡法(western blot), MTT法及流式細(xì)胞術(shù)(FCM)等檢測各組細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡情況。再以Notch2基因敲除的U251細(xì)胞株建立裸鼠皮下移植瘤模型,觀察Notch2對(duì)體內(nèi)腫瘤的生成和腫瘤生長的影響,為臨床腫瘤治療提供可靠的論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)共分為3個(gè)部分。 第一部分Notch2蛋白在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及意義 目的：研究Notch2蛋白在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及臨床意義。 方法：選擇膠質(zhì)瘤標(biāo)本22例和正常腦組織標(biāo)本20例為研究對(duì)象,采用免疫組化法檢測并比較其Notch2表達(dá),并分析Notch2表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的相關(guān)性。 結(jié)果：Notch2表達(dá)在膠質(zhì)瘤組織中顯著高于正常腦組織中Notch2表達(dá)(P0.001)。在Ⅰ～Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤中Notch2的表達(dá)顯著低于Ⅲ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中Notch2的表達(dá)(P0.01)。 結(jié)論：Notch2與膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),為膠質(zhì)瘤的診斷和治療提供新的思路和理論依據(jù)。 第二部分Notch2-shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響 目的：研究Notch2-shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響。 方法：構(gòu)建Notch2-shRNA干擾質(zhì)粒及相同載體的無意義序列Negative-shRNA對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251進(jìn)行轉(zhuǎn)染,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株,分別作為Notch2-shRNA干擾組和Negative-shRNA干擾組,并以未轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞作為未轉(zhuǎn)染對(duì)照組,利用實(shí)時(shí)定量PCR、蛋白印跡法(western blot)測定各組Notch2及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況,采用MTT法觀察各組U251細(xì)胞生長情況,采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測各組細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果：與Negative-shRNA干擾組和未轉(zhuǎn)染組相比,Notch2-shRNA干擾組細(xì)胞中Notch2蛋白及其活性片段NICD蛋白在Notch2-shRNA干擾組中表達(dá)顯著降低,cyclinD1和MCM2蛋白在Notch2-shRNA干擾組中的表達(dá)亦明顯降低,p21和p27蛋白的表達(dá)明顯升高。MTT生長曲線顯示,Notch2-shRNA干擾組細(xì)胞生長速度較Negative-shRNA干擾組和未轉(zhuǎn)染組更慢,尤其從第5天開始,Notch2-shRNA干擾組生長速度較其他兩組顯著降低(均P=0.0000.001)。Notch2-shRNA干擾組、Negative-shRNA組和未轉(zhuǎn)染組的U251細(xì)胞的凋亡率分別為(13.22±1.90)%、(2.62±0.26)%和(2.47±0.36)%,Notch2-shRNA干擾組顯著高于Negative-shRNA組和未轉(zhuǎn)染組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003,P=0.003)。在G1期,Notch2-shRNA干擾組細(xì)胞百分比顯著高于Negative-shRNA干擾組和未轉(zhuǎn)染組(P=0.0000.001,P=0.0000.001,),在S期,Notch2-shRNA干擾組細(xì)胞百分比顯著低于Negative-shRNA干擾組和未轉(zhuǎn)染組(P=0.0000.001,P=0.0000.001,)。 結(jié)論：Notch2與膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期有關(guān),抑制Notch2表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,使細(xì)胞周期在G1/S期被阻滯,其作用的發(fā)揮可能是通過下調(diào)cyclinD1和MCM2蛋白的表達(dá)和上調(diào)p21和p27蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。 第三部分Notch2-shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株U251的裸鼠皮下移植研究 目的：研究Notch2蛋白抑制的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251的致瘤性及對(duì)裸鼠生存時(shí)間的影響。 方法：以Notch2-shRNA及相同載體無意義序列Negative-shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的U251細(xì)胞株、和未轉(zhuǎn)染的U251細(xì)胞株建立裸鼠皮下移植瘤模型,每組各10只,定期測量腫瘤大小,繪制腫瘤生長曲線；移植后60天每組隨機(jī)取4只裸鼠處死,稱量瘤重并計(jì)算腫瘤抑制率,免疫組化法檢測腫瘤中Notch2表達(dá)水平；對(duì)各組其余裸鼠記錄并比較其生存時(shí)間。 結(jié)果：Notch2-shRNA轉(zhuǎn)染組裸鼠腫瘤生長較Negative-shRNA轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組更緩慢,腫瘤體積更小,至各組裸鼠接種第60d, Notch2-shRNA轉(zhuǎn)染組、Negative-shRNA轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組的腫瘤大小分別為(2.72±0.21)mm2、(9.23±0.17)mm2和(9.91±0.77)mm2, Notch2-shRNA轉(zhuǎn)染組裸鼠腫瘤體積顯著小于Negative-shRNA轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0000.001,P=0.0000.001)。細(xì)胞接種60d后Notch2-shRNA轉(zhuǎn)染組、Negative-shRNA轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組平均瘤重分別為(0.46±0.04)g、(1.32±0.03)g和(1.35±0.11)g,Notch2-shRNA轉(zhuǎn)染組瘤重顯著小于Negative-shRNA轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0000.001,P=0.0000.001)。Notch2-shRNA轉(zhuǎn)染組抑瘤率為65.74%; Notch2-shRNA轉(zhuǎn)染組Notch2表達(dá)明顯小于Negative-shRNA轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組(P0.01)。 Notch2-shRNA轉(zhuǎn)染組、Negative-shRNA轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組裸鼠生存時(shí)間分別為(114.33±9.05)d、(70.83±10.50)d和(71.67±8.82)d, Notch2-shRNA轉(zhuǎn)染組裸鼠的生存時(shí)間顯著長于Negative-shRNA轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組(P0.001)。 結(jié)論：抑制Notch2表達(dá)可顯著降低U251細(xì)胞的致瘤性,抑制膠質(zhì)瘤生成和進(jìn)展,為膠質(zhì)瘤的基因治療提供理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.41

【參考文獻(xiàn)】

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1 曾冉;況建國;;膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J];廣東醫(yī)學(xué);2013年06期

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本文編號(hào)：1557101