本文關(guān)鍵詞： TRPV1 離子通道 牡荊素 辣椒素 HIF-1α　出處：《武漢大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景：導(dǎo)致圍產(chǎn)期新生兒腦損傷的原因有很多,包括腦缺血缺氧、宮內(nèi)感染以及腦出血等,其中腦缺血缺氧是最常見的原因。新生兒腦缺血缺氧常常造成極高的死亡率及遠(yuǎn)期的神經(jīng)發(fā)育障礙。近年來研究發(fā)現(xiàn),神經(jīng)元的興奮性中毒、凋亡及炎癥的發(fā)生等參與了新生兒缺血缺氧性腦損傷的發(fā)病機(jī)制。在這個過程中,細(xì)胞內(nèi)鈣離子的聚集可以造成嚴(yán)重的細(xì)胞毒性損傷。之前大量研究表明,腦損傷時(shí)鈣離子的內(nèi)流主要由谷氨酸受體所介導(dǎo)。但近年來研究發(fā)現(xiàn),TRP家族的受體也參與調(diào)節(jié)腦損傷病理過程中鈣離子的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1 (Transient receptor potential vanilloidl)受體-TRPV1受體又稱辣椒素受體,是主要介導(dǎo)Ca2’內(nèi)流的非選擇性陽離子通道,是TRP超家族的一員。TRPV1受體主要表達(dá)于傷害感受器上,如：背根神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)節(jié)的初級感覺神經(jīng)元特定亞群,主要是探測機(jī)體受到的有害刺激,可以被辣椒素,熱刺激或者是酸所激活。最近有大量的研究表明TRPV1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)CNS (central nervous system)也廣泛表達(dá)。當(dāng)腦損傷時(shí),TRPV1會被大麻素和脂肪氧合酶產(chǎn)物所激活而加重腦損傷。因此,TRPV1可能是治療腦損傷的藥物潛在靶點(diǎn)。牡荊素是許多藥用植物中含有c-糖基化的黃酮類物質(zhì)之一。近年來,牡荊素因其廣泛的藥理作用而受到人們的關(guān)注。有研究指出牡荊素可以作為TRPV1潛在的抑制劑,減少疼痛傷害的行為。此外,黃酮類物質(zhì)劍葉龍血素B在大鼠背根神經(jīng)節(jié)上,可以抑制辣椒素所介導(dǎo)的激活電流。因此,牡荊素可以作為體內(nèi)和體外研究TRPV1功能的潛在藥物工具。新生大鼠腦缺血缺氧性損傷時(shí),早期抑制低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α(Hypoxic Inducible Factor-1α)的表達(dá)可以產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。與此同時(shí),有研究指出牡荊素是低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α (Hypoxic Inducible Factor-1α)的抑制劑。目的：(1)通過比較新生的Trpvl敲除小鼠和野生型小鼠在遭受缺血缺氧性腦損傷后,腦梗死、腦萎縮程度及動物行為學(xué)評分等,初步驗(yàn)證TRPV1受體在新生小鼠缺血缺氧腦損傷中的作用。(2)通過不同實(shí)驗(yàn)手段驗(yàn)證牡荊素干預(yù)治療新生小鼠缺血缺氧性腦損傷的效果,并且探討其藥理作用的機(jī)制及進(jìn)一步闡明TRPV1受體在新生小鼠缺血缺氧性腦損傷中的具體作用。(3)運(yùn)用新生大鼠缺血缺氧性腦損傷模型,驗(yàn)證牡荊素針對其他靶點(diǎn)發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)的作用。方法：(1)9日齡C57BL/6 trpvl敲除小鼠及野生型小鼠構(gòu)建HIBD模型。并運(yùn)用TRPV1受體的激動劑辣椒素干預(yù)治療,進(jìn)行TTC(2,3,5-一水氯化三苯基四氮唑)染色、Nissl染色及動物行為學(xué)等檢測,初步闡明TRPV1受體在新生小鼠HIBD中的作用。(2)9日齡C57BL/6小鼠構(gòu)建HIBD模型,對小鼠給予不同劑量的牡荊素預(yù)處理,通過TTC(2,3,5-一水氯化三苯基四氮唑)染色初步確定最佳給藥劑量。同時(shí)運(yùn)用Nissl染色、TUNEL染色及動物行為學(xué)等檢測,初步驗(yàn)證牡荊素對新生小鼠HIBD的神經(jīng)保護(hù)作用。(3)選取24小時(shí)內(nèi)出生的C57BL/6小鼠進(jìn)行原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng),培養(yǎng)到第12天時(shí)進(jìn)行OGD造模。通過MTT法、LDH釋放量以及PI染色等檢測,驗(yàn)證牡荊素在原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元上的保護(hù)作用。(4)利用Fura-2/AM熒光標(biāo)記探針對經(jīng)過OGD造模后的原代皮層神經(jīng)元進(jìn)行胞內(nèi)鈣離子的測定,并結(jié)合全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),驗(yàn)證牡荊素對TRPV1受體激活電流的作用。同時(shí),利用Western blot進(jìn)一步檢測牡荊素對TRPV1受體表達(dá)的影響。(5)利用Western blot手段檢測體內(nèi)及體外一系列信號通路相關(guān)的蛋白(CaMKII/p-CaMKII及凋亡蛋白)造模后的不同組表達(dá)變化。(6)選取7日齡的SD (Sprague Dawley)新生大鼠構(gòu)建HIBD模型,造模后對新生大鼠進(jìn)行不同劑量和不同時(shí)間的牡荊素干預(yù)治療。通過TTC(2,3,5-一水氯化三苯基四氮唑)染色初步確定最佳給藥劑量及時(shí)間。同時(shí)運(yùn)用Nissl染色、腦水腫檢測、IgG染色、腦萎縮檢測、足失誤及Morris水迷宮等方法,探究牡荊素的神經(jīng)保護(hù)作用。(7)通過Western blot和免疫組化的方法,檢測HIF-1α和VEGF在造模后不同組間的變化。結(jié)果：(1)TTC染色的結(jié)果顯示：缺血缺氧造模后,新生的trpvl敲除小鼠腦梗死體積較野生型小鼠顯著減少,并且對野生型小鼠給予TRPV1受體的激動劑辣椒素預(yù)處理,也呈現(xiàn)出藥物劑量依賴性的保護(hù)作用。但是,造模后給予辣椒素未見該保護(hù)效應(yīng)。Nissl染色和動物行為學(xué)檢測得到了同樣的結(jié)果。(2)小鼠進(jìn)行牡荊素預(yù)處理后,給藥組較模型組腦梗死體積明顯減少并呈現(xiàn)劑量依賴性。同時(shí),在腦萎縮和TUNEL染色結(jié)果均顯示：牡荊素預(yù)處理可以減少因缺血缺氧所造成的腦損傷。同時(shí),牡荊素還能提高遠(yuǎn)期神經(jīng)行為學(xué)的評分。(3) 原代神經(jīng)元經(jīng)氧糖剝奪造模后,發(fā)現(xiàn)牡荊素可顯著降低神經(jīng)元的死亡率及LDH的釋放量。同時(shí),PI染色的結(jié)果也證實(shí)了牡荊素的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。(4) Fura-2/AM熒光標(biāo)記探針對經(jīng)過OGD造模后的原代皮層神經(jīng)元進(jìn)行胞內(nèi)鈣離子濃度的測定,發(fā)現(xiàn)牡荊素可以顯著降低神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子的濃度。電生理實(shí)驗(yàn)則發(fā)現(xiàn)牡荊素可以抑制因辣椒素所引起的電流;Western blot結(jié)果提示牡荊素并不能改變神經(jīng)元TRPV1受體的表達(dá)。(5) Western blot結(jié)果顯示：牡荊素組可顯著提高腦損傷區(qū)域(皮層)Bcl-2/Bax的比例、而降低p-CaMKII/CaMKII、NF-κB和cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)。同時(shí),在原代皮層神經(jīng)元上也得到了同樣的結(jié)果。(6)TTC染色的結(jié)果顯示：缺血缺氧造模后,經(jīng)牡荊素早期(造模5 min后)干預(yù)治療的新生大鼠較模型組腦梗死體積明顯減少,并且呈一定劑量依賴性。但是,牡荊素(造模3h后)干預(yù)治療則未見該神經(jīng)保護(hù)作用。牡荊素最佳的藥物劑量可以明顯改善腦水腫情況、血腦屏障的破壞程度、神經(jīng)元的死亡、腦萎縮以及長期的動物行為學(xué)指標(biāo)等。而較模型組而言,低氧誘導(dǎo)因子的激動劑(DMOG)則加重了腦水腫以及血腦屏障的的破壞程度。(7) Western blot及免疫組化的結(jié)果顯示：牡荊素可以明顯降低因缺血缺氧所造成的高表達(dá)的低氧誘導(dǎo)因子及血管內(nèi)皮生長因子。結(jié)論：(1)我們發(fā)現(xiàn)新生的trpv1敲除小鼠可以顯著減少缺血缺氧所造成的傷害,并且TRPV1受體的激動劑辣椒素預(yù)處理可以對其產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。說明TRPV1受體的脫敏抑制可能對新生小鼠缺血缺氧性腦損傷產(chǎn)生保護(hù)效果。(2)預(yù)處理牡荊素可以通過減少腦梗死體積、抑制促凋亡的信號通路及提高行為學(xué)評分,從而對新生小鼠缺血缺氧性腦損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。而此神經(jīng)保護(hù)作用可能是牡荊素抑制了TRPV1受體的過度激活。(3)在新生大鼠腦缺血缺氧損傷中,牡荊素可以通過抑制低氧誘導(dǎo)因子,減少腦梗死體積、保護(hù)血腦屏障的完整性及腦水腫等,從而提供短期及長期的神經(jīng)保護(hù)作用。
[Abstract]:In recent years , it has been found that trpv1 can be used as a latent drug tool for the treatment of brain injury . The protective effects of vitexin on neonatal rat HIBD were studied by means of MTT assay , TUNEL staining and animal behavior . ( 1 ) The results showed that vitexin could significantly reduce the brain damage caused by ischemia and hypoxia . ( 6 ) The results of TTC staining showed that the cerebral edema and vascular endothelial growth factor were significantly reduced by the intervention of vitexin ( after 5 min ) .

【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R743
，

本文編號：1547694