本文關鍵詞： TRPV1 離子通道 牡荊素 辣椒素 HIF-1α　出處：《武漢大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景：導致圍產期新生兒腦損傷的原因有很多,包括腦缺血缺氧、宮內感染以及腦出血等,其中腦缺血缺氧是最常見的原因。新生兒腦缺血缺氧常常造成極高的死亡率及遠期的神經發(fā)育障礙。近年來研究發(fā)現(xiàn),神經元的興奮性中毒、凋亡及炎癥的發(fā)生等參與了新生兒缺血缺氧性腦損傷的發(fā)病機制。在這個過程中,細胞內鈣離子的聚集可以造成嚴重的細胞毒性損傷。之前大量研究表明,腦損傷時鈣離子的內流主要由谷氨酸受體所介導。但近年來研究發(fā)現(xiàn),TRP家族的受體也參與調節(jié)腦損傷病理過程中鈣離子的內穩(wěn)態(tài)。瞬時受體電位香草酸亞型1 (Transient receptor potential vanilloidl)受體-TRPV1受體又稱辣椒素受體,是主要介導Ca2’內流的非選擇性陽離子通道,是TRP超家族的一員。TRPV1受體主要表達于傷害感受器上,如：背根神經節(jié)和三叉神經節(jié)的初級感覺神經元特定亞群,主要是探測機體受到的有害刺激,可以被辣椒素,熱刺激或者是酸所激活。最近有大量的研究表明TRPV1在中樞神經系統(tǒng)CNS (central nervous system)也廣泛表達。當腦損傷時,TRPV1會被大麻素和脂肪氧合酶產物所激活而加重腦損傷。因此,TRPV1可能是治療腦損傷的藥物潛在靶點。牡荊素是許多藥用植物中含有c-糖基化的黃酮類物質之一。近年來,牡荊素因其廣泛的藥理作用而受到人們的關注。有研究指出牡荊素可以作為TRPV1潛在的抑制劑,減少疼痛傷害的行為。此外,黃酮類物質劍葉龍血素B在大鼠背根神經節(jié)上,可以抑制辣椒素所介導的激活電流。因此,牡荊素可以作為體內和體外研究TRPV1功能的潛在藥物工具。新生大鼠腦缺血缺氧性損傷時,早期抑制低氧誘導因子HIF-1α(Hypoxic Inducible Factor-1α)的表達可以產生神經保護作用。與此同時,有研究指出牡荊素是低氧誘導因子HIF-1α (Hypoxic Inducible Factor-1α)的抑制劑。目的：(1)通過比較新生的Trpvl敲除小鼠和野生型小鼠在遭受缺血缺氧性腦損傷后,腦梗死、腦萎縮程度及動物行為學評分等,初步驗證TRPV1受體在新生小鼠缺血缺氧腦損傷中的作用。(2)通過不同實驗手段驗證牡荊素干預治療新生小鼠缺血缺氧性腦損傷的效果,并且探討其藥理作用的機制及進一步闡明TRPV1受體在新生小鼠缺血缺氧性腦損傷中的具體作用。(3)運用新生大鼠缺血缺氧性腦損傷模型,驗證牡荊素針對其他靶點發(fā)揮其神經保護的作用。方法：(1)9日齡C57BL/6 trpvl敲除小鼠及野生型小鼠構建HIBD模型。并運用TRPV1受體的激動劑辣椒素干預治療,進行TTC(2,3,5-一水氯化三苯基四氮唑)染色、Nissl染色及動物行為學等檢測,初步闡明TRPV1受體在新生小鼠HIBD中的作用。(2)9日齡C57BL/6小鼠構建HIBD模型,對小鼠給予不同劑量的牡荊素預處理,通過TTC(2,3,5-一水氯化三苯基四氮唑)染色初步確定最佳給藥劑量。同時運用Nissl染色、TUNEL染色及動物行為學等檢測,初步驗證牡荊素對新生小鼠HIBD的神經保護作用。(3)選取24小時內出生的C57BL/6小鼠進行原代皮層神經元培養(yǎng),培養(yǎng)到第12天時進行OGD造模。通過MTT法、LDH釋放量以及PI染色等檢測,驗證牡荊素在原代培養(yǎng)的皮層神經元上的保護作用。(4)利用Fura-2/AM熒光標記探針對經過OGD造模后的原代皮層神經元進行胞內鈣離子的測定,并結合全細胞膜片鉗技術,驗證牡荊素對TRPV1受體激活電流的作用。同時,利用Western blot進一步檢測牡荊素對TRPV1受體表達的影響。(5)利用Western blot手段檢測體內及體外一系列信號通路相關的蛋白(CaMKII/p-CaMKII及凋亡蛋白)造模后的不同組表達變化。(6)選取7日齡的SD (Sprague Dawley)新生大鼠構建HIBD模型,造模后對新生大鼠進行不同劑量和不同時間的牡荊素干預治療。通過TTC(2,3,5-一水氯化三苯基四氮唑)染色初步確定最佳給藥劑量及時間。同時運用Nissl染色、腦水腫檢測、IgG染色、腦萎縮檢測、足失誤及Morris水迷宮等方法,探究牡荊素的神經保護作用。(7)通過Western blot和免疫組化的方法,檢測HIF-1α和VEGF在造模后不同組間的變化。結果：(1)TTC染色的結果顯示：缺血缺氧造模后,新生的trpvl敲除小鼠腦梗死體積較野生型小鼠顯著減少,并且對野生型小鼠給予TRPV1受體的激動劑辣椒素預處理,也呈現(xiàn)出藥物劑量依賴性的保護作用。但是,造模后給予辣椒素未見該保護效應。Nissl染色和動物行為學檢測得到了同樣的結果。(2)小鼠進行牡荊素預處理后,給藥組較模型組腦梗死體積明顯減少并呈現(xiàn)劑量依賴性。同時,在腦萎縮和TUNEL染色結果均顯示：牡荊素預處理可以減少因缺血缺氧所造成的腦損傷。同時,牡荊素還能提高遠期神經行為學的評分。(3) 原代神經元經氧糖剝奪造模后,發(fā)現(xiàn)牡荊素可顯著降低神經元的死亡率及LDH的釋放量。同時,PI染色的結果也證實了牡荊素的神經保護效應。(4) Fura-2/AM熒光標記探針對經過OGD造模后的原代皮層神經元進行胞內鈣離子濃度的測定,發(fā)現(xiàn)牡荊素可以顯著降低神經元胞內鈣離子的濃度。電生理實驗則發(fā)現(xiàn)牡荊素可以抑制因辣椒素所引起的電流;Western blot結果提示牡荊素并不能改變神經元TRPV1受體的表達。(5) Western blot結果顯示：牡荊素組可顯著提高腦損傷區(qū)域(皮層)Bcl-2/Bax的比例、而降低p-CaMKII/CaMKII、NF-κB和cleaved caspase-3蛋白的表達。同時,在原代皮層神經元上也得到了同樣的結果。(6)TTC染色的結果顯示：缺血缺氧造模后,經牡荊素早期(造模5 min后)干預治療的新生大鼠較模型組腦梗死體積明顯減少,并且呈一定劑量依賴性。但是,牡荊素(造模3h后)干預治療則未見該神經保護作用。牡荊素最佳的藥物劑量可以明顯改善腦水腫情況、血腦屏障的破壞程度、神經元的死亡、腦萎縮以及長期的動物行為學指標等。而較模型組而言,低氧誘導因子的激動劑(DMOG)則加重了腦水腫以及血腦屏障的的破壞程度。(7) Western blot及免疫組化的結果顯示：牡荊素可以明顯降低因缺血缺氧所造成的高表達的低氧誘導因子及血管內皮生長因子。結論：(1)我們發(fā)現(xiàn)新生的trpv1敲除小鼠可以顯著減少缺血缺氧所造成的傷害,并且TRPV1受體的激動劑辣椒素預處理可以對其產生神經保護作用。說明TRPV1受體的脫敏抑制可能對新生小鼠缺血缺氧性腦損傷產生保護效果。(2)預處理牡荊素可以通過減少腦梗死體積、抑制促凋亡的信號通路及提高行為學評分,從而對新生小鼠缺血缺氧性腦損傷產生保護作用。而此神經保護作用可能是牡荊素抑制了TRPV1受體的過度激活。(3)在新生大鼠腦缺血缺氧損傷中,牡荊素可以通過抑制低氧誘導因子,減少腦梗死體積、保護血腦屏障的完整性及腦水腫等,從而提供短期及長期的神經保護作用。
[Abstract]:In recent years , it has been found that trpv1 can be used as a latent drug tool for the treatment of brain injury . The protective effects of vitexin on neonatal rat HIBD were studied by means of MTT assay , TUNEL staining and animal behavior . ( 1 ) The results showed that vitexin could significantly reduce the brain damage caused by ischemia and hypoxia . ( 6 ) The results of TTC staining showed that the cerebral edema and vascular endothelial growth factor were significantly reduced by the intervention of vitexin ( after 5 min ) .

【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R743
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本文編號：1547694