本文關(guān)鍵詞： ATM 化療耐藥 RNA干擾 IFIT1 預(yù)后　出處：《福建醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:惡性腦膠質(zhì)瘤是預(yù)后最差的顱內(nèi)原發(fā)腫瘤,烷化劑替莫唑胺(temozolomide,TMZ)化療是惡性腦膠質(zhì)瘤綜合治療的重要組成部分,但是目前為止其臨床療效一直不能令人滿意,這與膠質(zhì)瘤對TMZ的化療耐藥密切相關(guān)。TMZ化療引起DNA損傷,啟動DNA損傷應(yīng)答(DNA damage response,DDR),可導(dǎo)致DNA損傷修復(fù),如DNA損傷重要的修復(fù)酶O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA Methyltransferase,MGMT)通過對甲基化鳥嘌呤的甲基的轉(zhuǎn)移,修復(fù)損傷的DNA,導(dǎo)致腫瘤對TMZ化療耐藥。MGMT的激活依賴于DDR的啟動,而毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)綜合癥突變基因(ataxia-telangiectasia mutated,ATM)是DDR上游的關(guān)鍵基因,在細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡和DNA修復(fù)中發(fā)揮重要作用,但其在膠質(zhì)瘤化療中的作用及機(jī)制尚未完全得到闡明。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)ATM沉默誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)的TMZ化療耐藥,所以本課題擬通過對膠質(zhì)瘤細(xì)胞中ATM的沉默,體外和體內(nèi)分別驗(yàn)證ATM在TMZ化療中的作用,篩選ATM沉默誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐TMZ的分子通路,并進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化研究,以期找到逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤化療耐藥的治療靶點(diǎn)或預(yù)測化療敏感性和預(yù)后的分子標(biāo)記,達(dá)到改善患者預(yù)后的目的。方法:(1)運(yùn)用RNA干擾的方法沉默膠質(zhì)瘤U87、U251細(xì)胞的ATM基因,建立ATM沉默的裸鼠皮下移植瘤模型;MTT法、流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測化療抑制率、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡評估ATM沉默后TMZ(IC50)化療對膠質(zhì)瘤U87、U251細(xì)胞增殖的影響,測量TMZ化療對裸鼠移植瘤的體積、重量的影響;(2)運(yùn)用美國Affymetrix公司的人類全基因組寡核苷酸基因芯片檢測U251細(xì)胞ATM基因沉默的表達(dá)譜改變;運(yùn)用高內(nèi)涵Cellomics篩選系統(tǒng)篩選由ATM誘導(dǎo)的、功能未完全明確的、與ATM沉默導(dǎo)致的TMZ化療耐藥相關(guān)的靶基因;(3)運(yùn)用RNA干擾的方法沉默所得靶基因;MTT法、流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測靶基因沉默對U251細(xì)胞TMZ(IC50)化療的增殖影響;(4)免疫組化法評估磷酸化的ATM(phosphorylated ATM,p-ATM)、所選靶基因、MGMT在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤手術(shù)標(biāo)本的表達(dá),分析表達(dá)的相關(guān)性及與臨床預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果:(1)獲得ATM基因沉默的U87、U251細(xì)胞株,兩細(xì)胞株TMZ(IC50)化療5天的抑制率分別為21.0±1.7%和29.1±3.0%低于陰性對照組的27.5±3.8%(p=0.008)和36.8±2.0%(p=0.001),細(xì)胞凋亡率為2.23±0.05%和15.31±1.71%低于陰性對照組的3.73±0.15%(p=0.000)和21.38±1.13%(p=0.001);獲得ATM沉默的膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型;TMZ停藥后第10天和第13天ATM沉默組細(xì)胞增殖倍數(shù)(與化療第一天的腫瘤體積相比)為4.00±3.68和5.72±4.92高于陰性對照組的1.18±0.18和1.22±0.19(p=0.027和0.012),實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)ATM沉默組移植瘤重量為0.213±0.246g小于陰性對照組的0.595±0.214g(p=0.002);(2)芯片篩選出U251細(xì)胞ATM沉默后差異表達(dá)基因726個(gè),按設(shè)定條件篩選出進(jìn)入下游檢測的靶基因16個(gè)。含有TPR結(jié)構(gòu)的干擾素誘導(dǎo)蛋白1基因(interferon-induced protein with tetratricopeptide repeat1,IFIT1)沉默的化療抑制率為8.77%低于陽性對照組的10.29%,為所有篩選靶基因中最低;(3)獲得IFIT1基因沉默的膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株;該細(xì)胞株TMZ(IC50)化療5天的抑制率和細(xì)胞凋亡率分別為15.3±2.1%和6.61±0.28%低于陰性對照組的29.3±4.9%(p=0.034)和7.43±0.41%(p=0.000);(4)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤存在p-ATM和IFIT1基因表達(dá)且表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.249,p=0.037),而IFIT1和MGMT的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.288,p=0.016);單因素和多因素分析均顯示IFIT1高表達(dá)患者有較長的無進(jìn)展生存期(progression-free survival,PFS)(p=0.003和0.017)和總體生存期(overall survival,OS)(p=0.001和0.001),“IFIT1高表達(dá)和MGMT低表達(dá)”組比“IFIT1低表達(dá)和MGMT高表達(dá)”組和“兩者同時(shí)高表達(dá)或同時(shí)低表達(dá)”組的患者有較長的PFS和OS。結(jié)論:(1)成功建立ATM基因穩(wěn)定沉默的膠質(zhì)瘤U87、U251細(xì)胞株和ATM沉默的U87細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型,驗(yàn)證了ATM沉默抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致TMZ化療耐藥;(2)在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中篩選得到與ATM沉默誘導(dǎo)的TMZ化療耐藥相關(guān)的、具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡功能的IFIT1基因;(3)成功建立IFIT1穩(wěn)定沉默的U251細(xì)胞株,驗(yàn)證了IFIT1沉默抑制其誘導(dǎo)凋亡的功能,導(dǎo)致U251細(xì)胞對TMZ化療耐藥,IFIT1可能成為預(yù)示膠質(zhì)瘤TMZ化療敏感性的分子標(biāo)記;(4)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中存在較廣泛的IFIT1表達(dá),IFIT1可作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤預(yù)后評判的分子標(biāo)記,聯(lián)合IFIT1與MGMT對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤預(yù)后的預(yù)測更準(zhǔn)確。
[Abstract]:鐩殑:鎭舵，

本文編號：1527188