本文關(guān)鍵詞： 依達拉奉 缺氧缺糖酸中毒 酸敏感離子通道 依達拉奉 缺氧缺糖復氧 PI3K/AKT通路 ERK通路　出處：《中南大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一章依達拉奉減輕缺氧復氧酸中毒誘導的神經(jīng)元毒性損傷的作用及分子機制研究 摘要 目的： 1研究依達拉奉對缺氧復氧酸中毒誘導的神經(jīng)元毒性損傷的作用； 2探討依達拉奉對缺氧復酸中毒損傷的神經(jīng)元保護的分子作用機制。 方法： 1建立缺氧缺糖復氧酸中毒(OGD-A/R)神經(jīng)元損傷模型,為消除谷氨酸鹽活性及電壓依賴的Ca2+通道作用,所有操作中均加入了NMDA和AMPA受體阻滯劑和電壓門控Ca2+通道拮抗劑； 2分空白對照組、OGD-A/R組、OGD-A/R加不同濃度依達拉奉組、OGD-A/R加ASICs阻斷劑組,檢測不同時段LDH釋放量、Caspase-3活性、Hoechst33258染色,并進行比較來評價依達拉奉對OGD-A/R損傷神經(jīng)元的保護作用； 3選擇適當濃度的依達拉奉、ASIC1a阻滯劑及MEK/ERK阻滯劑分別對不同組別OGD-A/R模型培養(yǎng)中的細胞進行預處理,用Western-blot檢測ERK、AKT及Bcl-2蛋白表達,RT-PCR檢測BDNF、 Bcl-2mRNA表達,ELISIA檢測BDNF蛋白表達,相應試劑盒或試劑檢測LDH釋放量(檢測細胞損傷)及]Hoechst33258染色(觀察細胞凋亡)。分析比較相應數(shù)據(jù)探討依達拉奉在OGD-A/R模型中可能的保護機制。 結(jié)果： 1成功建立了OGD-A/R模型,并發(fā)現(xiàn)4h和8h即可出現(xiàn)LDH釋放量爆發(fā)性增加。 2ASICs阻滯劑PcTX和amiloride預處理后予OGD-A/R操作4h和8h LDH釋放量顯著減少。與ASICs阻滯劑相對應,依達拉奉預處理繼以O(shè)GD-A/R操作可劑量依賴地減少損傷神經(jīng)元LDH釋放而產(chǎn)生與前者類似但更顯著的保護作用。 3與OGD-A/R組相比,依達拉奉預處理在各時點提高了BDNF和Bcl-2mRNA表達,且在OGD-A/R后8h作用最強；ELISIA檢測提示依達拉奉在同一時間點使BDNF蛋白表達增多；Western-blot則顯示在同一時間點依達拉奉在OGD-A/R后8h上調(diào)了Bcl-2蛋白表達；Caspase-3活性檢測結(jié)果顯示OGD-A/R極大地提高了Caspase-3活性,依達拉奉預處理可明顯降低這種Caspase-3活性的升高,且具有劑量依賴性。這種保護作用與ASICs阻斷劑使用后相當。 4與正常對照組比較,OGD-A/R神經(jīng)元p-AKT水平顯著提高,而依達拉奉或PcTX預處理后OGD-A/R則顯著抑制了AKT磷酸化。 5與正常對照組相比,OGD-A/R組或OGD-A/R并PcTX預處理組可引起p-ERK1/2活性輕度升高,而依達拉奉干預OGD-A/R后則可引起p-ERK1/2活性明顯升高。這種作用可被MEK/ERK阻斷劑PD98059(10μM) and U0126(5μM)阻斷； 6OGD-A/R誘導細胞損傷引起核染色質(zhì)斷裂和LDH釋放增多。而依達拉奉預處理可在很大程度上防止細胞核形態(tài)變化和減少LDH釋放。然而MEK/ERK阻滯劑PD98059和U0126預處理幾乎完全抵消了依達拉奉對OGD-A/R損傷神經(jīng)元抗凋亡能力。 結(jié)論： 1本研究首次發(fā)現(xiàn)依達拉奉能減輕缺氧復氧酸中毒誘導的神經(jīng)毒性損傷,且這一作用至少部分地依賴于ERK1/2的活性增強。 2缺氧復氧酸中毒條件下,依達拉奉可通過上調(diào)BDNF及Bcl-2的表達、抑制caspase-3活性達到神經(jīng)保護作用。 3ASICs通道激活是缺氧復氧酸中毒誘導的細胞毒性損傷重要機制之一,依達拉奉對缺氧復氧酸中毒損傷神經(jīng)元的保護作用可能與阻斷ASICs有關(guān)。 第二章依達拉奉減輕缺氧復氧誘導的神經(jīng)元毒性損傷的分子機制研究 摘要 目的： 1研究依達拉奉對缺氧復氧損傷神經(jīng)元的保護作用； 2探討依達拉奉減輕缺氧復氧引起的細胞毒性損傷、保護神經(jīng)元細胞的分子作用機制。 方法： 1建立缺氧缺糖復氧(OGD-R)神經(jīng)元損傷模型； 2分空白對照組、OGD-R組、OGD-R加不同濃度依達拉奉組,檢測不同時段LDH釋放量、Caspase-3活性、Hoechst33258染色(計算核固縮比例),并進行比較來評估依達拉奉對缺氧復氧損傷神經(jīng)元的保護作用； 3選擇適當濃度的依達拉奉及依達拉奉并特異性AKT阻斷劑LY294002和MK2206對細胞分別進行預處理后再行OGD-R處理,用Western-blot檢測ERK、AKT及Bcl-2蛋白表達,RT-PCR檢測BDNF、Bcl-2mRNA表達,ELISIA檢測BDNF蛋白表達,相應試劑盒或試劑檢測LDH釋放量及Hoechst33258染色。分析比較相應數(shù)據(jù)探討依達拉奉在OGD-R模型中可能的保護機制。 結(jié)果： 1成功建立了OGD-R模型,并發(fā)現(xiàn)在復氧后4h和8h即可出現(xiàn)明顯的病理學改變。 2依達拉奉預處理培養(yǎng)細胞減輕了缺氧復氧誘導的神經(jīng)元損傷程度(LDH釋放減少、Caspase-3活性和核固縮比例下降),且具有劑量依賴性。 3確定LDH釋放量檢測可以作為一個簡易可靠的衡量神經(jīng)元損傷的定量指標,該結(jié)論經(jīng)Caspase-3活性檢測和Hoechst33258染色檢測驗證。 4依達拉奉預處理后OGD-R, p-ERK的表達量沒有明顯變化,而p-AKT的表達量明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義,p0.01。 5依達拉奉預處理可明顯降低OGD-R處理細胞中LDH釋放和核固縮比例,p0.01,但該過程可被MK2206抑制。 6與OGD-R組比較,依達拉奉預處理顯著上調(diào)了BDNF和Bcl-2mRNA的表達,且在OGD-R8h時尤其明顯；ELISIA檢測提示依達拉奉在同一時間點使BDNF蛋白表達增多；Western-blot則顯示依達拉奉上調(diào)了Bcl-2蛋白表達,這種作用可被MK2206抑制。 結(jié)論： 1依達拉奉通過上調(diào)BDNF和Bcl-2的表達、抑制Caspase-3活性減輕缺氧復氧引起的神經(jīng)元毒性損傷,即在發(fā)生缺氧復氧不合并酸中毒損傷條件下,依達拉奉已經(jīng)具有神經(jīng)保護作用。 2PI3K/KT通路的激活可能是上述作用實現(xiàn)的重要途徑之一。
[Abstract]:Study on the effect and molecular mechanism of edaravone on the reduction of neuronal toxicity induced by hypoxia and reoxygenation
abstract
Objective:
1 to study the effect of edaravone on the toxicity of neurons induced by anoxic reoxygenation.
2 to investigate the mechanism of the molecular action of edaravone on the neuronal protection of anoxic reacid poisoning.
Method錛，

本文編號：1524394