本文關(guān)鍵詞： Miro1 癲癇 線粒體移動 氧化應(yīng)激　出處：《鄭州大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景與目的癲癇(epilepsy,EP)是常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,目前尚未明確癲癇的具體發(fā)病機制,抗癲癇藥物不能控制疾病的進展,終止癥狀使大腦對反復癇性發(fā)作更敏感,隨著時間的進展這種敏感性更加嚴重,這就要求我們進一步研究癲癇的發(fā)病機制,為癲癇治療尋找新靶點。線粒體對神經(jīng)遞質(zhì)合成、鈣穩(wěn)態(tài)、氧化還原反應(yīng)、活性氧的產(chǎn)生與調(diào)節(jié)以及神經(jīng)元凋亡起關(guān)鍵作用,線粒體功能障礙導致癲癇發(fā)作過程中氧化應(yīng)激增加,損傷線粒體DNA,引起脂質(zhì)過氧化,影響ATP利用,這些反應(yīng)對抗內(nèi)源性抗氧化機制的保護作用,導致神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重組、神經(jīng)元丟失、神經(jīng)干細胞移位,最終導致癲癇發(fā)作,破壞這一過程對研發(fā)新型抗癲癇藥物阻止癲癇發(fā)作非常關(guān)鍵。Miro1介導的線粒體移動通過不斷清除受損線粒體,將正常功能線粒體運輸至作用部位,維持線粒體正常功能,對神經(jīng)元發(fā)揮保護作用。因此癲癇發(fā)作過程中Miro1介導的線粒體移動有可能為臨床上治療癲癇提供新思路。Miro是線粒體外膜Rho GTPase家族的一員,它通過適配器蛋白(如Milton蛋白)與馬達分子(如驅(qū)動蛋白Kinesin)相連接。果蠅中Milton蛋白是首先被確定的將Miro蛋白與馬達分子鏈接的適配器蛋白。線粒體通過膜受體蛋白Miro連接適配器招募馬達分子。這些馬達分子/受體/適配器復合體確保目標線粒體的運輸,精確調(diào)節(jié)它們的分配以應(yīng)對神經(jīng)元活動的改變。最新研究表明果蠅中Miro既調(diào)節(jié)軸突中線粒體的順向運輸,也調(diào)節(jié)逆向運輸。果蠅中Miro突變損害線粒體運輸至神經(jīng)元遠端區(qū)域,最終導致軸突和突觸的線粒體消耗殆盡。神經(jīng)元有絲分裂后期的細胞經(jīng)歷與機體相同的生命周期,當機體老化或者功能紊亂時需要線粒體不斷移動至作用部位來補充能量。神經(jīng)元發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)或完整性受到破壞時線粒體會不斷改變運動來保證神經(jīng)元的正�；钚浴Ｒ虼苏{(diào)節(jié)線粒體運輸對滿足新陳代謝需求的變化、移除老化及受損線粒體、補充正常功能線粒體至神經(jīng)末梢至關(guān)重要。此次研究運用Sombati法,通過無鎂細胞外液誘導海馬神經(jīng)元體外癲癇模型,并構(gòu)建腺病毒真核表達質(zhì)粒干預Miro1表達,通過免疫蛋白印跡等多種方法檢測ND6、MDA及GSH表達水平的變化,探討Miro1對致癇海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激產(chǎn)生的影響,進一步明確能否通過調(diào)控線粒體移動發(fā)揮致癇神經(jīng)元的保護作用。方法將出生24小時內(nèi)的Sprague-Dawley大鼠,斷頭后剝離雙側(cè)大腦組織,然后置于磷酸鹽緩沖液(PBS)培養(yǎng)皿中,剝離雙側(cè)海馬組織,并制成單細胞懸液接種于培養(yǎng)板中進行原代培養(yǎng)。培養(yǎng)至14d的海馬神經(jīng)元隨機分為對照組(CON)、無鎂誘導組(AE)、AE+對照腺病毒轉(zhuǎn)染組(AE+rAdv)、AE+靶向Miro1基因的shRNA重組腺病毒轉(zhuǎn)染組(AE+rAd-Miro1-shRNA)。CON組與AE組分別用正常含鎂細胞外液及無鎂細胞外液培養(yǎng)3h后更換為維持液培養(yǎng)。AE+r Adv組、AE+rAd-Miro1-shRNA組于無鎂誘導48h前分別轉(zhuǎn)染不表達任何外源基因的對照腺病毒載體(rAdv)、靶向Miro1基因的shRNA重組腺病毒真核表達質(zhì)粒(rAd-Miro1-shRNA),并于造模24h后終止細胞培養(yǎng),用于后續(xù)實驗。通過倒置相差顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元特征,神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)染色鑒定海馬神經(jīng)元純度,采用Western blot法檢測細胞內(nèi)Miro1、ND6蛋白的表達,免疫熒光法檢測細胞內(nèi)ND6表達,比色法測定MDA、GSH的表達。結(jié)果神經(jīng)元形態(tài)學特征倒置相差顯微鏡下觀察到培養(yǎng)至7天時海馬神經(jīng)元體積變大,胞體成錐形,樹突及軸突清晰可見,細胞之間具有緊密聯(lián)系。神經(jīng)元純度測定神經(jīng)元特異性烯醇化酶NSE染色鑒定,培養(yǎng)至7天時海馬神經(jīng)元純度為90%以上。Miro1蛋白表達情況與CON組比較,AE組、AE+rAdv組Miro1表達升高,差異均具有統(tǒng)計學意義,P0.05;AE+rAd-Miro1-shRNA組Miro1表達降低,差異具有統(tǒng)計學意義,P0.05。與AE組比較,AE+rAdv組Miro1表達升高,差異無統(tǒng)計學意義,P0.05;AE+rAd-Miro1-shRNA組Miro1表達降低,差異具有統(tǒng)計學意義,P0.05。ND6蛋白表達情況(1)Western Blot法:與CON組比較,AE組、AE+rAdv組、AE+rAd-Miro1-shRNA組ND6表達降低,差異均具有統(tǒng)計學意義,P0.05。與AE組比較,AE+rAdv組ND6表達降低,差異無統(tǒng)計學意義,P0.05;AE+rAd-Miro1-shRNA組ND6表達降低,差異具有統(tǒng)計學意義,P0.05。(2)免疫熒光法:免疫熒光染色顯示,細胞質(zhì)呈紅色熒光,細胞核呈藍色熒光。運用ImageProPlus(IPP)圖像處理分析軟件分析,以累積光密度IOD(integrated optical density)作為胞質(zhì)內(nèi)ND6蛋白的相對表達量,其結(jié)果與Western Blot法檢測ND6蛋白表達情況一致。MDA蛋白表達情況與CON組比較,AE組、AE+rAdv組、AE+rAd-Miro1-shRNA組MDA表達升高,差異均具有統(tǒng)計學意義,P0.05。與AE組比較,AE+rAdv組MDA表達升高,差異無統(tǒng)計學意義,P0.05;AE+rAd-Miro1-shRNA組MDA表達升高,差異具有統(tǒng)計學意義,P0.05。GSH蛋白表達情況與CON組比較,AE組、AE+rAdv組、AE+rAd-Miro1-shRNA組GSH表達降低,差異均具有統(tǒng)計學意義,P0.05。與AE組比較,AE+rAdv組GSH表達降低,差異無統(tǒng)計學意義,P0.05;AE+rAd-Miro1-shRNA組GSH表達降低,差異具有統(tǒng)計學意義,P0.05。結(jié)論1.致癇神經(jīng)元Miro1蛋白反應(yīng)性升高,ND6蛋白降低,MDA蛋白升高,GSH蛋白降低,提示Miro1介導的線粒體移動參與癲癇病理過程,致癇后海馬神經(jīng)元產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。2.轉(zhuǎn)染rAd-Miro1-shRNA病毒后,致癇神經(jīng)元Miro1蛋白明顯降低,ND6蛋白進一步降低,MDA蛋白進一步升高,GSH蛋白進一步降低,海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷加重,提示Miro1蛋白介導的線粒體移動對致癇海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷具有保護作用。3.通過提高線粒體移動減輕氧化應(yīng)激損傷可能成為抗癲癇治療的新前景。
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【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R742.1

【參考文獻】

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本文編號：1513873