本文關(guān)鍵詞： 全腦缺血 Nogo-A 軸突再生 TAT-M9 TAT-NEP1-40 TAT-PEP 神經(jīng)元丟失 神經(jīng)功能　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：腦卒中是中國成年人中致死、致殘的首要病因，同時也是西方國家第二大致死病因。不僅如此，腦卒中后的幸存者還相繼發(fā)生了偏癱、失語等后遺癥從而使這些人的生活質(zhì)量嚴(yán)重下降。目前，纖維蛋白溶解療法和抗血小板聚集藥物的應(yīng)用是治療腦卒中最有效的方法。但是這些療法時間窗狹窄（4.5h），只有約10%的腦卒中后患者適用于再此療法且不能解決術(shù)后多種后遺癥。至今為止，腦卒中后神經(jīng)功能障礙的有效方法僅有復(fù)健鍛煉，但這種方法所需時間長且收效甚微。因此，研制出有效藥物從根本上解決腦卒中后長期的神經(jīng)功能障礙刻不容緩。 Nogo-A蛋白的發(fā)現(xiàn)，為治療中風(fēng)后神經(jīng)功能障礙帶來了希望。Nogo-A有抗CNS損傷后的突觸重建的作用。NgR1是Nogo-A的受體，抑制NgR1能促進(jìn)軸突再生。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，包含Nogo-A特定功能區(qū)域的TAT-M9蛋白無論在體內(nèi)還是體外實驗中均能在急性期減少活性氧的生成，抑制細(xì)胞凋亡。同時，NgR1的抗體蛋白TAT-NEP1-40能抑制Nogo-A作用增強(qiáng)大鼠腦缺血后短期的神經(jīng)突觸可塑性和神經(jīng)功能。而最近報道稱，腦缺血損傷后28天內(nèi)神經(jīng)元Nogo-A的表達(dá)在腦損傷早期（7d）下降，之后逐漸升高。依據(jù)Nogo-A在腦缺血后的空間表達(dá)特異性，我們擬用TAT-M9進(jìn)行急性期（7d）的抗凋亡治療，Nogo-A表達(dá)高峰時應(yīng)用TAT-NEP1-40促進(jìn)突觸重建，深入研究聯(lián)合應(yīng)用TAT-M9和TAT-NEP1-40的長期保護(hù)作用，為缺血性腦卒中提供新的治療方法。 PirB也是髓磷脂蛋白的功能性受體。有研究發(fā)現(xiàn)，基因敲除PirB后會引起比敲除NgR1更多的軸突再生。故此，推測PirB在髓磷脂抑制作用中占有更大的比例，提示PirB也可能成為腦卒中后康復(fù)治療的又一個作用靶點。為了抑制PirB的作用，我們利用PirB的細(xì)胞外段合成了PEP。然而，PEP的分子量過大，不能通過血腦屏障。因此，我們應(yīng)用蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)再一次合成了具有血腦屏障通透性的TAT-PEP融合蛋白。為進(jìn)一步明確PirB對缺血性腦卒中的治療作用提供了研究基礎(chǔ)。 因此，本課題以小鼠全腦缺血（BCCAO）模型和海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22氧糖剝奪（OGD）模型為對象，應(yīng)用免疫組織化學(xué)、蛋白印記和神經(jīng)行為學(xué)等方法，觀察聯(lián)合應(yīng)用TAT-M9和TAT-NEP1-40及TAT-PEP對腦缺血損傷后長期神經(jīng)保護(hù)作用，旨在提供針對缺血性腦卒中治療新的干預(yù)目標(biāo)和藥物，并且腦卒中后的治療模式提供新思路。 實驗一、TAT-M9對腦缺血損傷急性期的保護(hù)作用 目的：對小鼠全腦缺血7d后TAT-M9腦保護(hù)作用的觀察。 方法：采用C57BL/6小鼠，建立BCCAO模型，將小鼠隨機(jī)分為三組： Sham組（假手術(shù)組， n=6），Control組（0.5ml生理鹽水，，qd ip, n=6）和TAT-M9組（10mg/kg，qd ip, n=6），再灌注即刻給藥，之后每天同一時間段行藥物腹腔注射，連續(xù)7d。于首次藥物注射6h后，通過免疫組化染色觀察藥物通過血腦屏障情況。于第7d行總體運動評分（TMS）觀察BCCAO小鼠術(shù)的自主神經(jīng)運動能力。應(yīng)用HE染色觀察并計數(shù)腦缺血7d后神經(jīng)元的存活情況。采用TUNEL染色觀察并計數(shù)小鼠缺血后7d海馬神經(jīng)元的凋亡情況，通過western blot明確Bcl-2和Bax在海馬的表達(dá)情況。 結(jié)果：成功建立了BCCAO模型，觀察到TAT-M9可通過血腦屏障進(jìn)入腦缺血區(qū)，并表達(dá)于海馬神經(jīng)元。TAT-M9治療可改善BCCAO術(shù)7d小鼠的TMS評分（P0.01）。TAT-M9治療使BCCAO術(shù)后海馬CA1區(qū)存活神經(jīng)元數(shù)量顯著增加（P0.01）。TAT-M9治療還可顯著減少BCCAO術(shù)后7d海馬CA1區(qū)TUNEL陽性神經(jīng)元數(shù)目（P0.01），同時TAT-M9還提高Bcl-2/Bax的相對值（P0.01）。 結(jié)論：TAT-M9能穿過血腦屏障進(jìn)入腦海馬CA1區(qū)和神經(jīng)元內(nèi)，減少腦缺血再灌注損傷急性期（7d）的神經(jīng)元損傷，抑制神經(jīng)凋亡，減少神經(jīng)元丟失，促進(jìn)神經(jīng)元存活，改善小鼠的自主神經(jīng)運動能力。 實驗二、聯(lián)合應(yīng)用TAT-M9與TAT-NEP1-40對腦缺血損傷的長期保護(hù)作用 目的：觀察聯(lián)合應(yīng)用TAT-M9與TAT-NEP1-40對小鼠全腦缺血損傷后的長期神經(jīng)保護(hù)作用 方法：采用C57BL/6小鼠，建立BCCAO模型，小鼠隨機(jī)分成四組：Control組（0.5ml生理鹽水，qd ip, n=30），TAT-M9組（10mg/kg，qd ip, n=30），TAT-NEP1-40組（6mg/kg，qd ip, n=30），TAT-M9+TAT-NEP1-40組。TAT-M9組于再灌注即刻給藥，持續(xù)7d；TAT-NEP1-40組于第8d給藥，持續(xù)至28d；TAT-M9+TAT-NEP1-40組于再灌注即刻給予TAT-M9，連續(xù)7d，從第8d給予TAT-NEP1-40，持續(xù)至28d。于BCCAO后28d通過被動回避平臺實驗、高架十字迷宮和恐懼箱實驗鑒定治療后小鼠的短期記憶能力。應(yīng)用曠場實驗檢測小鼠自主運動功能。應(yīng)用Morris水迷宮和T迷宮觀察小鼠長期記憶能力。通過免疫熒光染色觀察注射6h后TAT-NEP1-40通過血腦屏障，及治療28d后缺血區(qū)軸突生長情況。通過western blot明確28d后BCCAO小鼠軸突生長因子（Tau、GAP43和MAP2）表達(dá)量的變化情況。 結(jié)果：成功建立了BCCAO模型，觀察到TAT-NEP1-40通過血腦屏障并表達(dá)于海馬神經(jīng)元。TAT-M9和TAT-NEP1-40聯(lián)合治療能促進(jìn)Tau、GAP43和MAP2的表達(dá)（P0.01），促進(jìn)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元軸突生長。TAT-M9和TAT-NEP1-40聯(lián)合治療還能提高BCCAO小鼠28d后短期空間學(xué)習(xí)和記憶能力（P0.01）及短期的關(guān)聯(lián)性和條件暗示性記憶能力（P0.05）；TAT-M9和TAT-NEP1-40聯(lián)合治療也改善了BCCAO小鼠28d后長期空間學(xué)習(xí)和記憶能力（P0.01）以及長期工作記憶和參考記憶能力（P0.01）。 結(jié)論：長時程聯(lián)合應(yīng)用TAT-M9和TAT-NEP1-40能促進(jìn)損傷區(qū)神經(jīng)軸突再生，提高腦缺血損傷后小鼠短期及長期的空間學(xué)習(xí)記憶能力，促進(jìn)缺血損傷后的神經(jīng)功能恢復(fù)。 實驗三、TAT-PEP對氧糖剝奪HT22細(xì)胞的保護(hù)作用及軸突生長的影響 目的：通過離體研究，明確TAT-PEP是否能促進(jìn)氧糖剝奪（OGD）的HT22細(xì)胞的軸突再生。 方法：采用小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22細(xì)胞，首先應(yīng)用MTT確定TAT-PEP的最佳有效濃度。其次將細(xì)胞分為三組：Sham組、OGD組、OGD+TAT-PEP組，細(xì)胞復(fù)氧后24h后，免疫熒光染色觀察3d后細(xì)胞軸突再生情況。 結(jié)果：當(dāng)TAT-PEP濃度為150μg/L時，OGD后細(xì)胞存活數(shù)最多。且TAT-PEP顯著促進(jìn)OGD模型24h后的神經(jīng)元軸突生長。 結(jié)論：TAT-PEP可作用于神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)突的再生。 實驗四、TAT-PEP長期治療對腦缺血損傷保護(hù)與神經(jīng)功能的影響 目的：通過在體實驗，明確TAT-PEP對小鼠全腦缺血后是否具有長期的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng) 方法：采用C57BL/6小鼠，建立BCCAO模型，將小鼠隨機(jī)分為三組： Sham組（假手術(shù)組， n=40），Control組（0.5ml生理鹽水，qd ip, n=40）和TAT-PEP組（150μg/kg，qd ip, n=40），再灌注即刻給藥，連續(xù)28d。首次藥物注射6h、24h、48h后通過免疫熒光染色觀察藥物通過血腦屏障情況。應(yīng)用HE染色和Nissl染色觀察并計數(shù)BCCAO小鼠7d后神經(jīng)元的存活情況。采用TUNEL染色統(tǒng)計BCCAO小鼠7d后神經(jīng)元的凋亡情況，應(yīng)用FJC染色統(tǒng)計BCCAO小鼠7d后神經(jīng)元變性情況。通過western blot明確28d后BCCAO小鼠軸突生長因子（Tau和GAP43）表達(dá)量的變化情況。MAP2免疫熒光檢測損傷區(qū)軸突再生情況。通過被動回避平臺試驗、高架十字迷宮和恐懼箱實驗鑒定治療后小鼠的短期記憶能力。應(yīng)用曠場實驗檢測小鼠自主運動功能。應(yīng)用Morris水迷宮和T迷宮觀察小鼠長期記憶能力。 結(jié)果：成功建立了BCCAO模型，觀察到TAT-PEP通過血腦屏障表達(dá)于海馬神經(jīng)元，并于24h是表達(dá)量最高。TAT-PEP治療可明顯增加BCCAO術(shù)后7d神經(jīng)元在海馬CA1區(qū)的存活數(shù)量（P0.01）；TAT-PEP治療顯著增加BCCAO術(shù)后7d海馬CA1區(qū)Nissl陽性神經(jīng)元數(shù)目（P0.01）；TAT-PEP治療可顯著減少BCCAO術(shù)后7d海馬CA1區(qū)TUNEL陽性神經(jīng)元數(shù)目（P0.01）；TAT-PEP治療還可顯著減少BCCAO術(shù)后7d海馬CA1區(qū)FJC陽性神經(jīng)元數(shù)目（P0.01）。TAT-PEP治療能促進(jìn)Tau（P0.05）及GAP43（P0.01）的表達(dá)，促進(jìn)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元軸突生長。TAT-PEP治療還能提高BCCAO小鼠28d后短期空間學(xué)習(xí)記憶能力（P0.05，P0.01）及短期的關(guān)聯(lián)性和條件暗示性記憶能力（P0.05）；TAT-PEP治療也改善了BCCAO小鼠28d后長期空間學(xué)習(xí)記憶能力（P0.05，P0.01）以及長期工作記憶和參考記憶能力（P0.05，P0.01）。 結(jié)論：TAT-PEP治療能減少腦缺血損傷后短期的神經(jīng)元的變性和凋亡，促進(jìn)神經(jīng)元的存活。促進(jìn)損傷區(qū)神經(jīng)軸突再生，提高腦缺血損傷后小鼠短期和長期的記憶能力。 小結(jié)：以上研究證實，TAT-M9、TAT-NEP1-40和TAT-PEP均能通過BBB，作用于損傷神經(jīng)元；TAT-M9可以減少缺血損傷區(qū)的神經(jīng)元丟失，抑制凋亡，改善缺血急性期的神經(jīng)功能；聯(lián)合應(yīng)用TAT-M9和TAT-NEP1-40治療顯著促進(jìn)軸突再生，對缺血性損傷后的小鼠的長期和短期的空間學(xué)習(xí)及記憶能力均明顯提高，強(qiáng)效且長久的改善小鼠的神經(jīng)功能；TAT-PEP不僅在缺血早期增加損傷區(qū)的神經(jīng)元存活，抑制凋亡，并且長期治療后還能促進(jìn)軸突再生，提高小鼠長期和短期的空間學(xué)習(xí)及記憶功能，促進(jìn)小鼠缺血晚期的神經(jīng)功能恢復(fù)。本項研究為今后由CNS相關(guān)疾病引起的神經(jīng)功能障礙患者的康復(fù)治療提供新的治療靶點、治療方法及藥物。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R743.3

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本文編號：1513395