本文關(guān)鍵詞： 海人藻酸 海馬神經(jīng)元 神經(jīng)毒性損傷 小膠質(zhì)細(xì)胞 細(xì)胞因子　出處：《吉林大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：興奮性毒性是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種退行性疾病的重要發(fā)病機(jī)制。海人藻酸（KA）誘導(dǎo)嚙齒類動(dòng)物出現(xiàn)興奮性毒性損傷是研究人類神經(jīng)退行性變的有效模型。相關(guān)研究證實(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活與KA致神經(jīng)元死亡密切相關(guān)。其中小膠質(zhì)細(xì)胞（Microglia）在神經(jīng)炎性及退行性疾病發(fā)生發(fā)展中的作用具有兩面性，即不同亞型的Microglia可分別發(fā)揮促炎（M1型）或抗炎（M2型）作用。因此，本實(shí)驗(yàn)通過體外誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞向不同亞型分化，檢測M2型小膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用及其減輕神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)的分子生物學(xué)機(jī)制，為神經(jīng)炎性疾病的免疫治療提供新的思路和治療靶點(diǎn)。 目的： 本研究應(yīng)用KA誘導(dǎo)建立原代培養(yǎng)的小鼠海馬神經(jīng)元毒性損傷模型，并對新生小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)、分選及誘導(dǎo)分化，建立海馬神經(jīng)元與分化后的小膠質(zhì)細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型，探討不同亞型小膠質(zhì)細(xì)胞在KA誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性過程中的不同作用，意在闡明M2型小膠質(zhì)細(xì)胞可保護(hù)海馬神經(jīng)元免受KA誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用及其抗炎機(jī)制。 方法： （1）取E16-18胎鼠大腦行海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)，再應(yīng)用KA誘導(dǎo)建立神經(jīng)元毒性損傷模型后，通過檢測CCK8、NO含量、LDH含量評估神經(jīng)損傷程度及機(jī)制；（2）取P1-P3新生小鼠行小膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)，應(yīng)用免疫磁珠進(jìn)行分選后加入不同組合的細(xì)胞因子進(jìn)行誘導(dǎo)分化，以流式細(xì)胞儀對分化后的小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2進(jìn)行表型鑒定，并以ELISA測定分化后的M1/M2分泌的細(xì)胞因子含量；（3）建立海馬神經(jīng)元與分化后的小膠質(zhì)細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型，通過檢測CCK8、NO和LDH產(chǎn)量評估共培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元活性的影響及損傷程度，并在共培養(yǎng)24小時(shí)后加入KA刺激24小時(shí)，檢測CCK8、LDH含量評估不同亞型小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2與神經(jīng)元共培養(yǎng)對KA致神經(jīng)元損傷的影響，Western Blot檢測NFκB蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果： 1）KA可對原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元造成興奮性毒性損傷。在200uM KA刺激24小時(shí)后，，大部分的海馬神經(jīng)元出現(xiàn)死亡及軸突損傷，神經(jīng)元活性CCK8僅為51.7±8.6%，LDH和NO產(chǎn)量明顯增加，Western Blot結(jié)果提示KA致神經(jīng)元損傷后NFκB及Caspase3表達(dá)水平明顯升高。 2）小膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)后應(yīng)用抗CD11b免疫磁珠可成功進(jìn)行小膠質(zhì)細(xì)胞的分選，流式細(xì)胞儀顯示CD11b陽性率可達(dá)92.7±5.3%。 3）以LPS和IFNγ聯(lián)合刺激可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型分化，呈現(xiàn)“阿米巴樣”活化狀態(tài)，細(xì)胞胞體變大，突起回縮變粗、變短，流式細(xì)胞儀表型測定結(jié)果顯示iNOS+, CD40+, IL-12/23p40high, IL-10low，符合M1型的特異性表型標(biāo)志。ELISA檢測結(jié)果顯示分化后的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞可分泌高水平的促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IFN-γ和IL-6），明顯高于對照組和M2型（P0.01，n=3）。 4）IL-4，IL-10和TGF-β聯(lián)合刺激可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型分化，細(xì)胞胞體變小、細(xì)長，突起變少、形成較長、粗大的突起。流式細(xì)胞儀表型鑒定顯示CD206+, Arg-1+, IL-12/23p40low, IL-10high，符合M2型的特異性表型標(biāo)志,。ELISA檢測結(jié)果顯示分化后的M2型小膠質(zhì)細(xì)胞可分泌高水平的抗炎細(xì)胞因子（IL-4和IL-10），明顯高于對照組和M1型（P0.01，n=3）。 5）成功建立海馬神經(jīng)元與分化后的小膠質(zhì)細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型。分化后M1型小膠質(zhì)細(xì)胞與海馬神經(jīng)元共培養(yǎng)可造成大部分海馬神經(jīng)元死亡、軸突斷裂，共培養(yǎng)24小時(shí)后神經(jīng)元活性CCK8僅為51.59%±19.40%（n=3），LDH和NO產(chǎn)量明顯增高；而與M2型小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的神經(jīng)元活性無明顯影響，CCK8為96.60%±3.21%（n=3），LDH和NO產(chǎn)量略升高，Western Blot檢測NFκB蛋白表達(dá)水平顯示N+M1組明顯高于N+M2組，兩組間比較有顯著性差異（P0.01）。 6）與M1型小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的神經(jīng)元再加入KA刺激后出現(xiàn)神經(jīng)元損傷加重，神經(jīng)元活性CCK8僅為32.36%±11.13%，LDH和NO產(chǎn)量明顯增高；而與M2型小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的神經(jīng)元在加入KA刺激后僅有輕度軸突損傷、少許細(xì)胞死亡，CCK8為80.39%±11.81%，NO產(chǎn)量無明顯升高，Western Blot檢測NFκB蛋白表達(dá)水平顯示N+M1+KA組明顯高于N+M2+KA組，兩組間比較有顯著性差異（P0.05）。 結(jié)論： 1) KA體外誘導(dǎo)可成功建立海馬神經(jīng)元興奮性毒性損傷模型。KA可能通過上調(diào)NFκB及Caspase3信號途徑發(fā)揮誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的作用。 2)體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞可在LPS和IFN-γ聯(lián)合作用下分化為M1亞型，在IL-4、IL-10和TGF-β聯(lián)合作用下分化為M2亞型，兩者可表達(dá)相應(yīng)的表型標(biāo)志和分泌相應(yīng)的細(xì)胞因子。 3)誘導(dǎo)分化后的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞可導(dǎo)致共培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元出現(xiàn)損傷，且可加重KA對神經(jīng)元的興奮性毒性損傷；而分化后的M2型小膠質(zhì)細(xì)胞則對共培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元無損傷，且可在體外保護(hù)海馬神經(jīng)元免受KA誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用。 4) M2型小膠質(zhì)細(xì)胞可能通過分泌抗炎細(xì)胞因子、抑制NO產(chǎn)生、下調(diào)NFκB等信號途徑來保護(hù)神經(jīng)元免受KA的毒性損傷作用，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞則通過相反的途徑來加重神經(jīng)元的毒性損傷。
[Abstract]:Excitotoxicity is an important pathogenesis of various neurodegenerative disease of the human central nervous system. Kainic acid (KA) induced rodent animal excitotoxic injury is an effective model to study human neurodegeneration. Studies have shown that activation of microglia and astrocytes and KA induced neuronal death is closely related which microglia (Microglia) in inflammatory and degenerative disorders in the occurrence and development of function has two sides, namely the different subtypes of Microglia can play a proinflammatory or anti-inflammatory (type M1) (type M2). Therefore, this experiment in vitro induced microglial cell differentiation to different molecular subtypes the biological mechanism of inflammation protective effect of detection of M2 microglia on nerve cells and relieve the nervous system, provide ideas and new therapeutic targets for immunotherapy of neuroinflammatory diseases.
Objective:
The establishment of mouse hippocampal neuron injury model induced cultured in this study by KA, and the neonatal mouse microglial cells were cultured, sorting and differentiation, in vitro differentiation of hippocampal neurons and microglial cells after co culture model, to explore the different effects of different subtypes of microglia in KA induced neurotoxicity in M2, to clarify the microglia can protect hippocampal neurons against neurotoxicity and its anti inflammation mechanism induced by KA.
Method錛

本文編號：1504978