本文關(guān)鍵詞： 紫草素 膠質(zhì)瘤 程序性壞死 受體相互作用蛋白激酶-1 活性氧　出處：《吉林大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景： 膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的顱內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤，據(jù)報道，該腫瘤占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的35.26%～60.96%[1]。由于惡性膠質(zhì)瘤在中樞神經(jīng)系統(tǒng)呈浸潤性快速生長等特點(diǎn)決定了外科手術(shù)不能將腫瘤全部清除干凈，并且惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞能夠耐受術(shù)后的放療和化療，所以雖然臨床上采用了外科手術(shù)、放射治療、化學(xué)藥物治療、生物治療等多種措施綜合治療仍然難于根治[3]。通過上述標(biāo)準(zhǔn)治療方案治療后，患者的中位總生存期也僅僅在14-16個月[4]，最近的研究顯示：惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐受放療及化療的主要原因是膠質(zhì)瘤細(xì)胞抵抗細(xì)胞凋亡[23]。所以研發(fā)能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡的新途徑的新藥顯得十分重要。 大量的研究曾報道shikonin能夠誘導(dǎo)乳腺癌、肝細(xì)胞癌以及膠質(zhì)瘤等多種腫瘤細(xì)胞凋亡[18-21]，然而，Han WD等研究證實shikonin能夠誘導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生Necroptosis，該作用能有效的規(guī)避腫瘤化療中的耐藥性問題[22]，因此，紫草素能否誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生Necroptosis仍需進(jìn)一步實驗證實，，證實這個問題能夠幫助我們進(jìn)一步明確紫草素抗膠質(zhì)瘤的具體機(jī)制，為臨床上克服腫瘤細(xì)胞化療的難題提供有力的實驗與理論指導(dǎo)。 目的： 本研究中，我們采用大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6及人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87探討紫草素能否誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞程序性壞死以及受體相互作用蛋白激酶-1在紫草素誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞程序性壞死中的作用。 方法： 1、通過MTT法檢測紫草素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的死亡率，并且進(jìn)一步探索necrotatin-1（Nec-1）、z-VAD-fmk以及NAC對該種細(xì)胞死亡的作用。 2、通過Annexin V-FITC/PI(propidium iodide)雙染色法用流式細(xì)胞儀檢測紫草素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的死亡方式。 3、通過透射電鏡直接觀察紫草素處理過的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。 4、通過Hoechst33342及PI雙染色用熒光顯微鏡觀察紫草素處理過的膠質(zhì)瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。 5、通過DCFH-DA探針處理觀察紫草素處理后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的ROS水平的變化。 6、通過Western blot分析程序性壞死相關(guān)蛋白RIP-1的表達(dá)水平的變化。 結(jié)果： 1、MTT檢測細(xì)胞成活率顯示：紫草素能夠誘導(dǎo)C6及U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡，并且在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)時間和濃度依賴性，紫草素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡能夠被程序性死亡特異性抑制劑necrotatin-1（Nec-1）特異性阻斷，而不能被泛caspase抑制劑z-VAD-fmk阻斷，并且實驗結(jié)果還顯示:抗氧化劑NAC能夠明顯抑制紫草素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。 2、Annexin V-FITC和PI雙染色通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的死亡方式，結(jié)果顯示：不同濃度的紫草素處理C6及U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞3h后，Annexin V-/Pl+區(qū)域和Annexin V+/Pl+區(qū)域的細(xì)胞百分比明顯增加，并且呈現(xiàn)時間和濃度依賴性，該區(qū)域的細(xì)胞百分比增加能夠被程序性死亡特異性抑制劑Nec-1阻斷，而不能被泛caspase抑制劑z-VAD-fmk阻斷。 3、透射電鏡觀察紫草素處理過的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為：正常的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞微絨毛突出于表面，細(xì)胞核核膜平滑，細(xì)胞器狀態(tài)良好。但是經(jīng)過紫草素處理后細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)電子密度明顯降低，細(xì)胞膜完整性被破壞，核膜完整性喪失。 4、熒光顯微鏡觀察紫草素處理過的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)Hoechst33342及PI雙染色后細(xì)胞形態(tài)及著色的不同。熒光顯微鏡下表現(xiàn)為正常狀態(tài)的C6細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)正常為圓形并且被染色成深藍(lán)色，而紫草素處理過的細(xì)胞部分細(xì)胞核形態(tài)正常，但是染色成深藍(lán)色和紅色，還有部分細(xì)胞核皺縮，被染色成淡藍(lán)色和紅色，而經(jīng)過Nec-1預(yù)處理之后紫草素作用的細(xì)胞，染色顯示細(xì)胞核形態(tài)正常但染色成深藍(lán)色和紅色的部分明顯減少，而呈現(xiàn)細(xì)胞核皺縮被染色成淡藍(lán)色和紅色的細(xì)胞未見明顯減少。 5、DCFH-DA探針處理觀察處理后細(xì)胞的ROS水平的變化，熒光顯微鏡下表現(xiàn)為：紫草素處理后的細(xì)胞內(nèi)ROS濃度明顯升高、熒光顏色明顯變亮，該ROS濃度能夠被Nec-1及抗氧化劑NAC降低，并且它們引起的降低也降低了細(xì)胞的死亡率。 6、Western blot分析程序性壞死相關(guān)蛋白RIP-1的表達(dá)變化，實驗結(jié)果顯示：RIP-1的表達(dá)水平與紫草素處理呈現(xiàn)濃度及時間依賴性，并且RIP-1的表達(dá)水平不僅能夠被Nec-1抑制，也能夠被NAC降低。 結(jié)論： 1、紫草素能夠明顯誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡，并且主要是通過誘導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死實現(xiàn)的。 2、紫草素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞程序性壞死是通過誘導(dǎo)RIP-1高表達(dá)實現(xiàn)的。 3、紫草素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生程序性壞死的過程中有大量ROS的產(chǎn)生，抑制ROS能夠明顯抑制Necroptosis的發(fā)生。
[Abstract]:Background:
Glioma is the most common intracranial primary malignant tumor of the nervous system, according to the report, the tumor was the primary intracranial tumor in 35.26% ~ 60.96%[1]. due to Malignant Glioma Infiltrating characteristics of fast growth determines the surgery can not be cleared of all tumors in the central nervous system, and malignant glioma cells can be tolerated after surgery the radiotherapy and chemotherapy, although the clinical use of surgery, radiotherapy, chemotherapy, biological therapy and other comprehensive treatment measures is still difficult to cure [3]. through the standard treatment after treatment, patients with a median overall survival was only 14-16 months [4], recent studies have shown that: the main reason of radiotherapy and the chemotherapy of malignant glioma cell tolerance is drug resistance to apoptosis of [23]. glioma cells so the development of new ways to induce glioma cell death was ten It's important.
A large number of studies have reported that shikonin can induce breast cancer, hepatocellular carcinoma and glioma tumor cell apoptosis in [18-21], however, Han WD confirmed that shikonin could induce leukemia cells Necroptosis, which can avoid the chemotherapy drug resistance [22], effective therefore, shikonin can induce glioma cells Necroptosis still needs further experiments, confirmed that this problem can help us to further clarify the shikonin anti glioma specific mechanism, to provide experimental and theoretical guidance for the clinical effective to overcome the problem of tumor cells in chemotherapy.
Objective:
In this study, we used rat glioma cells C6 and human glioma cell U87 to explore whether shikonin can induce glioma cell necrosis and receptor interacting protein kinase -1 in shikonin induced glioma cell programmed necrosis.
Method錛

本文編號：1497198