本文關(guān)鍵詞： α-Synuclein Tau 黑質(zhì)網(wǎng)狀部 細(xì)胞凋亡 PV+神經(jīng)元 MAP1A　出處：《中山大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景:帕金森氏病(Parkinson’s Disease,PD)是最常見的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。其病理特征表現(xiàn)為中腦多巴胺能神經(jīng)元(midbrain dopaminergic neurons,m DANs)數(shù)目發(fā)生進(jìn)行性和選擇性的減少,殘余的多巴胺能神經(jīng)元胞體內(nèi)有以α-核突觸蛋白(α-Synuclein,α-Syn)為主要組成成分的路易小體(Lewy bodies,LBs)和路易突起(Lewy neurites,LNs)形成。寡聚體狀態(tài)的α-Syn的毒性作用和聚集狀態(tài)的α-Syn最終均會(huì)引起m DANs的凋亡。Tau屬于微管相關(guān)蛋白家族,主要分布于神經(jīng)元的軸突內(nèi),其正常生理功能為穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)微管組裝,參與細(xì)胞內(nèi)部的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。越來越多的研究表明Tau也參與了PD的發(fā)病過程,Tau也是參與LB纖維聚集的一種組成成分,與α-Syn有共定位的現(xiàn)象,并且能夠相互促進(jìn)聚集。但是,二者之間如何相互作用以及該相互作用在PD發(fā)病機(jī)制及病理過程的影響仍未明了。因而,本文利用三轉(zhuǎn)基因型小鼠模型,觀察不同表達(dá)水平的Tau(高表達(dá),正常表達(dá),半劑量表達(dá),以及不表達(dá))對(duì)特異性表達(dá)在中腦的A53T突變型α-Syn介導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用的影響。目的:1.研究不同表達(dá)水平的Tau對(duì)α-Syn聚集的影響。2.研究不同表達(dá)水平的Tau對(duì)α-Syn介導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用的影響。3.進(jìn)一步探索α-Syn和Tau在體內(nèi)相互作用的可能機(jī)制。方法:1.三轉(zhuǎn)基因型小鼠的構(gòu)建:將以pituitary homeobox 3(Pitx3)為中腦組織特異性啟動(dòng)子的攜帶有四環(huán)素反式作用因子(tetracycline transactivator,t TA)的小鼠(即Pitx3-t TA基因knockin小鼠,下簡(jiǎn)稱Pitx3小鼠),和攜帶有四環(huán)素操縱子(tetracycline operator,tet-O)-A53T突變型人α-Syn的轉(zhuǎn)基因小鼠(即Tet-O-A53Tα-Syn小鼠,下簡(jiǎn)稱A53T小鼠),分別與human-Tau(h Tau)小鼠和Tau-/-小鼠交配,得到所需的雙轉(zhuǎn)基因小鼠:Pitx3/h Tau小鼠和Pitx3/0/Tau+/-小鼠,以及A53T/h Tau小鼠和A53T/0/Tau+/-小鼠。然后再將Pitx3/h Tau小鼠和A53T小鼠交配,A53T/h Tau小鼠和Pitx3小鼠交配,得到目的基因型小鼠:Pitx3/A53T/h Tau小鼠;將Pitx3/0/Tau+/-小鼠和A53T/0/Tau+/-小鼠交配,得到目的基因型小鼠:Pitx3/A53T/0/Tau+/+小鼠,Pitx3/A53T/0/Tau+/-小鼠和Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠。2.行為學(xué)檢測(cè):利用滾輪實(shí)驗(yàn)、抓力實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn),對(duì)雄性三轉(zhuǎn)基因型小鼠及其正常對(duì)照——非轉(zhuǎn)基因型(non-transgenic,n Tg)小鼠分別在2,6,12和18月齡時(shí)進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)分析。3.利用免疫組織化學(xué)的方法對(duì)三轉(zhuǎn)基因型小鼠及n Tg小鼠的中腦部位:黑質(zhì)致密部(substantia nigra pars compacta,SNC),腹側(cè)被蓋區(qū)(ventral tegmental area,VTA)和紅核后核區(qū)(retro-rubral field,RRF)的m DANs的標(biāo)記物——酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)分析。4.利用免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三轉(zhuǎn)基因型小鼠及n Tg小鼠中腦部位的α-Syn,鈣離子結(jié)合受體分子-1(ionized calcium-binding adaptor molecule-1,Iba1),膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP),微小白蛋白(parvalbumin,PV),神經(jīng)元核抗原(neuronal nuclei,Neu N),微管相關(guān)蛋白1A(microtubule-associated protein 1A,MAP1A)和突觸后密度蛋白-95(postsynaptic density-95,PSD-95)等的表達(dá)情況。5.利用Jade-C和Tunel染色檢測(cè)三轉(zhuǎn)基因型小鼠及n Tg小鼠中腦部位細(xì)胞的死亡和凋亡情況。利用Nissl染色標(biāo)記神經(jīng)元。6.利用Western blot檢測(cè)三轉(zhuǎn)基因型小鼠及n Tg小鼠在2,6,12和18月齡時(shí),中腦部位的Tau,TH,高分子量α-Syn(HMW-α-Syn),129位點(diǎn)絲氨酸磷酸化的α-Syn(phospho-Ser129-α-Syn,p Ser129),MAP1A和PSD-95的表達(dá)。7.利用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-IP)實(shí)驗(yàn)探究α-Syn和MAP1A是否具有直接相互作用關(guān)系。結(jié)果:1.三轉(zhuǎn)基因型(Pitx3/A53T/0/h Tau,Pitx3/A53T/0/Tau+/+,Pitx3/A53T/0/Tau+/-,Pitx3/A53T/0/Tau-/-)小鼠自出生后均表現(xiàn)出明顯的震顫、步態(tài)不穩(wěn)等帕金森病樣癥狀,其體重值自1月齡起顯著地低于n Tg小鼠。行為學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明三轉(zhuǎn)基因小鼠的行為能力普遍弱于n Tg小鼠。其中,抓力結(jié)果顯示三轉(zhuǎn)基因型小鼠前后肢的抓力值都明顯低于n Tg小鼠,但三轉(zhuǎn)基因型小鼠之間并沒有顯著差別;滾輪實(shí)驗(yàn)表明三轉(zhuǎn)基因型小鼠的平衡協(xié)調(diào)能力較弱,其中Pitx3/A53T/0/Tau+/-小鼠自6月齡起,相比于其他三轉(zhuǎn)基因型小鼠有更弱的趨勢(shì);曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠在12月齡時(shí)出現(xiàn)焦慮樣的高水平方向的活動(dòng)癥狀。2.三轉(zhuǎn)基因型小鼠中腦部位(SNC、VTA和RRF)的TH+細(xì)胞數(shù)目相比于n Tg小鼠,均有顯著的減少。其中,SNC和VTA部位的減少更明顯,2月齡時(shí),三轉(zhuǎn)基因型小鼠SNC部位和VTA部位的TH+細(xì)胞分別減少約20%和30%(p0.001);至18月齡時(shí),三轉(zhuǎn)基因型小鼠SNC部位和VTA部位的TH+細(xì)胞則分別減少約50%和60%(p0.001);而RRF部位的減少自6月齡起開始表現(xiàn)出明顯差異(p0.05),12月齡起差異性更為顯著(p0.001);但各三轉(zhuǎn)基因型小鼠之間的TH+細(xì)胞數(shù)目并沒有顯著差異。利用Western blot檢測(cè)各組中腦部位TH蛋白表達(dá)含量的實(shí)驗(yàn)也同樣發(fā)現(xiàn),三轉(zhuǎn)基因型小鼠的TH表達(dá)水平自2月齡起相比于n Tg小鼠就已顯著降低(p0.001),但三轉(zhuǎn)基因型小鼠之間并沒有顯著差異。3.α-Syn在三轉(zhuǎn)基因型小鼠m DANs的胞質(zhì)、胞核及軸突均有明顯的表達(dá)。在對(duì)各基因型小鼠的HMW-α-Syn檢測(cè)發(fā)現(xiàn),三轉(zhuǎn)基因型小鼠自6月齡起在中腦部位就能檢測(cè)到HMW-α-Syn的表達(dá),在12和18月齡時(shí),與n Tg小鼠相比,三轉(zhuǎn)基因型小鼠中腦部位HMW-α-Syn的表達(dá)顯著增多(p0.001),而Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠有表達(dá)更多的趨勢(shì)。然而,各基因型小鼠中腦內(nèi)p Ser129α-Syn的表達(dá)水平并沒有顯著性差異。4.Jade-C和Tunel染色的檢測(cè)結(jié)果顯示,自12月齡起,9三轉(zhuǎn)基因型小鼠黑質(zhì)網(wǎng)狀部(substantia nigra pars reticulata,SNR)都出現(xiàn)有不同程度的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,其中,Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠的凋亡細(xì)胞數(shù)目更多。而對(duì)各基因型小鼠SNR部位的星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)和小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba1)的活化狀態(tài)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠在2月齡時(shí)即有明顯的膠質(zhì)細(xì)胞激活現(xiàn)象。5.與n Tg小鼠相比,三轉(zhuǎn)基因型小鼠SNR部位的PV+神經(jīng)元表達(dá)量較少。其中,Pitx3/A53T/0/h Tau,Pitx3/A53T/0/Tau+/+,Pitx3/A53T/0/Tau+/-小鼠的PV+神經(jīng)元數(shù)目沒有明顯差異和變化,并可存活至18月齡以上。而Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠SNR部位的PV+神經(jīng)元?jiǎng)t在12和18月齡時(shí)出現(xiàn)大量丟失,相較于n Tg小鼠,其PV+神經(jīng)元數(shù)目顯著減少(p0.001),亦明顯少于其他三轉(zhuǎn)基因型小鼠(p0.05)。6.在各三轉(zhuǎn)基因型小鼠的SNR部位,Tunel+細(xì)胞同時(shí)為Nissl+,說明在三轉(zhuǎn)基因型小鼠SNR部位凋亡的細(xì)胞是神經(jīng)元;在Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠SNR部位,其PV+神經(jīng)元丟失前(6月齡時(shí)),Neu N+與PV+共染;PV+神經(jīng)元丟失后(12和18月齡時(shí)),Neu N+與Tunel+表達(dá)高度共定位,而在其他三轉(zhuǎn)基因型小鼠SNR部位,Neu N+很少表達(dá),且與Tunel+不共定位。說明在Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠SNR部位,PV+神經(jīng)元的大量丟失可能經(jīng)歷了由Neu N+到Tunel+的過渡階段,Neu N+表達(dá)可能是SNR部位PV+神經(jīng)元退變的指示性標(biāo)記。7.在各三轉(zhuǎn)基因小鼠的SNR部位,α-Syn主要圍繞著PV+神經(jīng)元聚集表達(dá)。其中,在Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠中,α-Syn的聚集隨年齡逐漸增多,而PV+神經(jīng)元?jiǎng)t顯著減少。在紋狀體部位,α-Syn也主要聚集于PV+投射纖維周圍,而Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠紋狀體部位的投射纖維的數(shù)量也明顯減少。8.Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠中腦部位的MAP1A蛋白表達(dá)水平在2和6月齡時(shí)均高于其他基因型小鼠,但在12和18月齡時(shí)則明顯下降至最低。而其他三基因型小鼠的MAP1A蛋白表達(dá)水平基本恒定,與n Tg小鼠相比沒有明顯差異,并且隨年齡也沒有明顯變化。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在SNR部位,MAP1A+與PV+共定位;其中,Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠自12月齡起,SNR部位的MAP1A發(fā)生明顯退變,表達(dá)顯著減少;其他基因型小鼠至18月齡,MAP1A的形態(tài)和表達(dá)仍沒有明顯改變。9.與n Tg小鼠相比,Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠中腦部位的PSD-95蛋白表達(dá)水平自2月齡起即發(fā)生明顯減少(p0.01);而在其他三基因型小鼠則至6月齡時(shí)才出現(xiàn)顯著減少(p0.01)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠在2月齡時(shí),SNR部位的PSD-95就已發(fā)生退變,而其他三基因型小鼠則在12月齡時(shí),SNR部位的PSD-95才發(fā)生退變。結(jié)論:1.Tau含量的減少會(huì)加重Pitx3/A53T小鼠的行為學(xué)障礙,但Tau完全缺失進(jìn)一步導(dǎo)致Pitx3/A53T小鼠出現(xiàn)焦慮樣癥狀。2.Tau含量的減少會(huì)加速α-Syn聚集,并且加劇A53Tα-Syn在SNR部位介導(dǎo)的神經(jīng)退變。3.在Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠的SNR部位,PV+神經(jīng)元發(fā)生顯著的進(jìn)行性細(xì)胞凋亡,并可能經(jīng)歷了由PV+到Neu N+再到Tunel+的退變至死亡的過渡過程。而在其他三轉(zhuǎn)基因型小鼠的SNR部位,發(fā)生細(xì)胞凋亡的主要是PV-神經(jīng)元。4.在SNR部位,PV+與MAP1A+呈現(xiàn)共定位染色。自12月齡起,隨著A53Tα-Syn聚集的加劇,Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠SNR部位早期補(bǔ)償Tau缺失的MAP1A表達(dá)顯著減少;這可能是造成PV+神經(jīng)元大量丟失,導(dǎo)致Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠表現(xiàn)出明顯焦慮樣癥狀的主要原因,提示MAP1A可能具有促進(jìn)PV+神經(jīng)元存活的保護(hù)作用。5.A53Tα-Syn的聚集會(huì)導(dǎo)致PSD-95表達(dá)顯著減少。在Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠SNR部位發(fā)生PSD-95退變要早于其他三轉(zhuǎn)基因型小鼠,并且早于MAP1A的退變,提示PSD-95退變可能是導(dǎo)致MAP1A發(fā)生退變的上游機(jī)制。
[Abstract]:鐮旂┒鑳屾櫙:甯曢噾媯皬鐥，

本文編號(hào)：1470572