本文關(guān)鍵詞： 杜氏肌營養(yǎng)不良癥 胚胎植入前遺傳學(xué)診斷 多重置換擴增-全基因組擴增 多重巢式PCR 胚胎植入前遺傳學(xué)單體型分析 熒光-PCR　出處：《中南大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：杜氏肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy, DMD; OMIM310200)是一種神經(jīng)肌肉系統(tǒng)常見的X-連鎖隱性遺傳病,主要累及男嬰,在存活男嬰中發(fā)病率約1/3500～1/6000,其主要臨床特征為緩慢進行性加重的對稱性肌肉無力和萎縮,患者多起病于3-5歲,出現(xiàn)走路姿勢異常、易跌倒、肌無力等癥狀,12歲前喪失站立和行走能力,20歲左右死于呼吸困難、心力衰竭。本病是由位于Xp21.2的dystrophin基因突變導(dǎo)致,該基因全長約2.4Mb,約占X染色體全長的1.5%,是目前人類已發(fā)現(xiàn)的最大基因,其cDNA全長13974bp,共有79個外顯子,其編碼一種相對分子質(zhì)量為32萬道爾頓的肌養(yǎng)蛋白。近65%患者由一個或多個dystrophin基因外顯子的缺失所致,5%由重復(fù)突變導(dǎo)致,30%由點突變導(dǎo)致。 胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(Preimplantation genetic diagnosis, PGD)可通過篩選正常的胚胎移植,以防止遺傳學(xué)異常妊娠的發(fā)生,避免了反復(fù)流產(chǎn)、引產(chǎn)對孕婦及其家庭造成的傷害。 目前已有DMD-PGD相關(guān)報道,多重巢式PCR、連鎖分析、限制性酶切等方法都在其PGD考慮之中,但這些方法僅限于對單細胞幾個位點進行直接擴增,有位點少、擴增效率低、不能重復(fù)、條件要求高等缺點。對于臨床PGD十分不利,因此全基因組擴增將模板量大幅提高,避免上述問題的產(chǎn)生。目前全基因組擴增已發(fā)展出引物延伸預(yù)擴增(Primer extension preamplification, PEP)技術(shù)和簡并寡核苷酸引物PCR (Degenerate oligonucleotide primed-polymerase chainreaction, DOP-PCR)技術(shù)及多重置換擴增技術(shù)(multiple displacement amplification, MDA)。MDA技術(shù)已成為目前最有發(fā)展前景的WGA技術(shù)。 目的： 本研究通過使用多重巢式PCR和MDA的全基因組擴增技術(shù)對4個DMD家系完成PGD預(yù)實驗,在實驗中優(yōu)化DMD-PGD預(yù)實驗流程,并對多重巢式PCR和MDA-WGA方法對單細胞的擴增效率及診斷準確率和ADO發(fā)生率進行評估,對DMD-PGD中現(xiàn)有的10個STR位點進行有效率評價,最后對其中存在的問題進行討論分析。 材料： 本研究材料來自4個家系中患者或(和)其直系親屬,患者及相關(guān)成員外周血標本于我院遺傳中心抽取,并進行抽提gDNA和分離單淋巴細胞。 家系Ⅰ：分子編號M13742,家系中女性攜帶者年齡34歲,生育一患兒,基因診斷提示女性攜帶者的dystrophin基因第12-16號外顯子雜合缺失； 家系Ⅱ：分子編號M5841,家系中女性攜帶者年齡41歲,生育一患兒,基因診斷提示女性攜帶者的dystrophin基因存在C.7705CT雜合無義突變,并曾經(jīng)行連鎖分析； 家系Ⅲ：分子編號M13501,家系中女性攜帶者年齡41歲,生育一患兒,14歲夭折,但未保留樣本,基因診斷提示女性攜帶者的dystrophin基因存在c.6318GA雜合無義突變,取女性攜帶者及其父母血樣； 家系Ⅳ：分子編號M13691,家系中僅有患兒,為新發(fā)生突變,基因診斷提示患兒的dystrophin基因存在第48-52號外顯子缺失,其母親則未見異常,年齡40歲。 方法： 1、制備單個淋巴細胞和抽提外周血gDNA 2、家系gDNA水平PCR擴增和熒光-PCR擴增,通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和熒光電泳對DMD-STR位點2CA、5CA、7CA、4CA、45CA、49CA、50CA、59CA、63CA、79CA進行連鎖分析,確定能提供連鎖信息的位點。 3、單個淋巴細胞通過多重巢式PCR或MDA-WGA進行初級擴增 4、多重巢式PCR初級擴增產(chǎn)物和MDA純化產(chǎn)物各位點的熒光PCR的擴增 5、通過測序儀熒光電泳對熒光PCR產(chǎn)物進行分析及通過瓊脂糖凝膠電泳對缺失位點普通PCR產(chǎn)物進行分析 6、對需要測序的PCR產(chǎn)物進行回收、純化及測序分析 結(jié)果： 1、單體型分析結(jié)果 家系Ⅰ單體型分析結(jié)果,能提供連鎖信息位點共4個,分別為5CA、44CA、45CA、50CA;家系Ⅱ單體型分析結(jié)果,能提供連鎖信息位點共3個,分別為44CA、49CA、50CA;家系Ⅲ單體型分析結(jié)果,能提供連鎖信息位點共4個,分別為7CA、44CA、50CA、63CA;家系Ⅳ單體型分析結(jié)果,能提供連鎖信息位點共6個,分別為2CA、5CA、44CA、45CA、59CA、63CA。 2、各家系單淋巴細胞擴增效率及ADO率 家系Ⅰ共完成184個位點的擴增,擴增成功及診斷準確率99.5%(183/184)、ADO率為0,家系Ⅱ共完成153個位點的擴增,擴增成功及診斷準確率為99.3%(152/153)、ADO率為0,家系Ⅲ共完成180個位點的擴增,擴增成功及診斷準確率為100%(180/180)、ADO率為1.1%(178/180),家系Ⅳ共完成480個位點的擴增,擴增成功及診斷準確率為99.8%(479/480)、ADO率為0。 3、多重巢式PCR方案和MDA-WGA方案的擴增效率及ADO率比較 運用多重巢式PCR擴增方案總共擴增產(chǎn)物337個,擴增成功及診斷準確率為99.4%(335/337),ADO率為0(0/335)；運用MDA-WGA方案總共擴增產(chǎn)物660個,擴增成功率為99.8%(659/660),ADO率為0.3%(2/659)。經(jīng)χ2檢驗,兩者擴增成功率P0.05差異無統(tǒng)計學(xué)意義,ADO率P0.05,無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： 1、本實驗共完成了4家DMD家系的PGD預(yù)實驗,單細胞多重巢式PCR方案和MDA-WGA方案的各位點擴增成功率均90%,ADO率均10%,達到臨床PGD要求,能夠應(yīng)用于臨床PGD,這為DMD患者的臨床PGD的開展提供了強有力的技術(shù)支撐。 2、雖然多重巢式PCR方案和MDA-WGA方案的擴增成功率和ADO率無統(tǒng)計學(xué)差異。但MDA-WGA在多位點分析上更有優(yōu)勢,這樣能更有效地提高單細胞診斷DMD的準確率。 3、多位點連鎖分析不僅能監(jiān)測污染的發(fā)生,同時也能完成PGD診斷分析,拓寬了PGD的診斷范圍,增加了PGD診斷的準確性,降低了誤診的發(fā)生。
[Abstract]:Duchenne muscular dystrophy (Duchenne muscular, dystrophy, DMD; OMIM310200 X-) is an X-linked recessive disease common neuromuscular system, mainly involved in the survival of the baby boy, the incidence rate of about 1/3500 ~ 1/6000, characterized by slowly progressive symmetrical muscle weakness and atrophy, patients in onset 3-5 years old, appeared abnormal walking posture, easy to fall, muscle weakness and other symptoms before the age of 12, the loss of standing and walking ability, about 20 years old died of dyspnea, heart failure. This disease is caused by mutations in dystrophin gene is located in Xp21.2, the gene is about 2.4Mb, accounting for about 1.5% of the length of the X chromosome, is the largest human genes are present that, the full-length cDNA of 13974bp, a total of 79 exons, encoding a molecular mass of 320 thousand Dalton dystrophin. Nearly 65% of patients by one or more exons of dystrophin gene The result of deletion, 5% is caused by repeated mutation, and 30% is caused by point mutation.
Preimplantation genetic diagnosis (PGD) can screen normal embryo transfer to prevent the occurrence of abnormal genetic pregnancy, avoid repeated abortion, and induce injury to pregnant women and their families.
At present, DMD-PGD reports, multiplex PCR, linkage analysis, restriction enzyme digestion method in the PGD account, but these methods are only limited to several single cell sites were directly amplified loci have less amplification efficiency is low, can not be repeated, conditions and requirements of the disadvantages. Is unfavorable for clinical PGD, so all genome amplification will be a substantial increase in the amount of template, avoid the above problems. At present, whole genome amplification has developed primer (Primer extension, preamplification, PEP) and degenerate oligonucleotide primed PCR (Degenerate oligonucleotide primed-polymerase chainreaction, DOP-PCR) technology and multiple displacement amplification (multiple displacement amplification MDA.MDA) technology has become the most promising WGA technology.
Objective:
This study completed PGD pre experiment on 4 DMD pedigrees by whole genome amplification using multiplex nested PCR and MDA, the optimization of DMD-PGD process in pre experiment, experiment, and the multiplex nested PCR and MDA-WGA methods on accuracy of amplification efficiency and diagnosis of single cells and ADO assessment rate of 10 STR. Site of existing DMD-PGD for efficiency evaluation, finally the existing problems are discussed.
Material Science錛，

本文編號：1450696