本文關(guān)鍵詞：磁刺激通過PEA-15對星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移的影響及機(jī)制　出處：《鄭州大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景及目的星形膠質(zhì)細(xì)胞磷酸化蛋白PEA-15(Phosphoprotein enriched in astrocytes-15k Da)廣泛存在于細(xì)胞質(zhì),位于常染色體Iq21-22,其含有一個DED結(jié)構(gòu)域(death effector domain,DED)---死亡效應(yīng)區(qū),抑制細(xì)胞凋亡。ERK1/2(Extracellular signal-regulated kinases)參與細(xì)胞增殖、存活和細(xì)胞遷移等多種細(xì)胞進(jìn)程。磁刺激可通過激活ERK通路,促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移,并對中樞神經(jīng)損傷后的炎癥反應(yīng)等起到重要的神經(jīng)保護(hù)作用。PEA-15通過結(jié)合ERK1/2阻止其在細(xì)胞核中聚集,調(diào)控EKR1/2功能,其與磁刺激對星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移作用密切相關(guān)。本研究主要是在體外實(shí)驗(yàn)中觀察磁刺激是否可通過調(diào)節(jié)PEA-15影響ERK1/2通路,調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移作用,并探討其作用機(jī)制。資料與方法1.星形膠質(zhì)細(xì)胞的提取、培養(yǎng)、細(xì)胞免疫熒光鑒定:解剖新生1-3天SD(Sprague-Dawley)大鼠獲取大腦皮質(zhì)組織,運(yùn)用差速貼壁技術(shù)分離培養(yǎng),獲取星形膠質(zhì)細(xì)胞,并觀察其形態(tài)及生長,然后應(yīng)用免疫熒光技術(shù)鑒定GFAP蛋白的表達(dá)。2.實(shí)驗(yàn)分組:體外劃痕試驗(yàn),根據(jù)不同的磁刺激強(qiáng)度將實(shí)驗(yàn)分為3組:(1)對照組(不給予磁刺激,但細(xì)胞同其他刺激組置于同一環(huán)境中);(2)A組(給予30%最大磁刺激強(qiáng)度);(3)B組(給予60%最大磁刺激強(qiáng)度)。3.干擾PEA-15表達(dá)后劃痕試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分組:(1)A組(不給予磁刺激,進(jìn)行陰形si RNA轉(zhuǎn)染);(2)B組(不給予磁刺激,但對細(xì)胞進(jìn)行PEA-15 si RNA轉(zhuǎn)染,干擾PEA-15表達(dá));(3)C組(給予磁刺激,進(jìn)行陰性si RNA轉(zhuǎn)染);(4)D組(給予磁刺激,同時進(jìn)行si RNA轉(zhuǎn)染,干擾PEA-15表達(dá))。觀察劃痕愈合情況,并運(yùn)用Western Blot觀察PEA-15及其蛋白磷酸化的表達(dá)變化。利用熒光測定轉(zhuǎn)染效率;Western Blot半定量測定干擾效果。結(jié)果1.從新生1-3天大鼠腦皮質(zhì)中提取,經(jīng)差速貼壁分離、培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞,細(xì)胞免疫熒光鑒定膠質(zhì)纖維酸性蛋白GFAP表達(dá)陽性,DAPI染核測定細(xì)胞純度較高。2.在體外劃痕實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),隨著磁刺激強(qiáng)度的增加,劃痕面積愈合越快,在30%-60%最大磁刺激強(qiáng)度的強(qiáng)度下,星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移速度和強(qiáng)度呈正相關(guān),與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染熒光提示該轉(zhuǎn)染試劑具有較高的轉(zhuǎn)染效率,對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行PEA-15蛋白的測定,Western Blot結(jié)果提示si RNA270具有最佳的干擾效果。劃痕實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染組與磁刺激組均較正常組遷移明顯。磁刺激組的P-PEA-15增加明顯。結(jié)論1.差速貼壁結(jié)合搖床方法可培養(yǎng)純度較高的高星形膠質(zhì)細(xì)胞。2.體外劃痕實(shí)驗(yàn)中,在磁刺激30%-60%的強(qiáng)度下可明顯促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移。3.干擾PEA-15的表達(dá)后可明顯促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移,磁刺激后可能通過磷酸化PEA-15而促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移。
[Abstract]:Background and objective PEA-15(Phosphoprotein enriched in astrocytes-15k Da). It is widely found in the cytoplasm. It is located on autosomal Iq21-22 and contains a DED domain death effector domain-death effector region. Inhibition of apoptosis. ERK1 / 2 extracellular signal-regulated kineses were involved in cell proliferation. Magnetic stimulation can promote astrocyte migration by activating ERK pathway. It also plays an important neuroprotective role in the inflammatory response after central nervous system injury. PEA-15 inhibits its aggregation in the nucleus and regulates the function of EKR1/2 by binding with ERK1/2. It is closely related to the effect of magnetic stimulation on the migration of astrocytes. This study is mainly to investigate whether magnetic stimulation can affect the ERK1/2 pathway by regulating PEA-15 in vitro. Regulating the migration of astrocytes and exploring its mechanism. Data and methods 1. Extraction and culture of astrocytes. Cellular immunofluorescence identification: the cerebral cortex was obtained from the SD Sprague-Dawley rats at 1-3 days after dissection. Astrocytes were isolated and cultured by differential adherent technique. The morphology and growth of GFAP protein were observed, and then the expression of GFAP protein was identified by immunofluorescence technique. 2. Experiment group: in vitro scratch test. According to the different intensity of magnetic stimulation, the experiment was divided into 3 groups: control group (not given magnetic stimulation, but the cells were placed in the same environment as other stimulation groups); Group A (given 30% maximum magnetic stimulation intensity); Group B (60% maximum intensity of magnetic stimulation). Scratch test after interfering with PEA-15 expression was divided into two groups: group A (no magnetic stimulation, negative si RNA transfection); Group B (no magnetic stimulation), but the cells were transfected with PEA-15 si RNA, which interfered with the expression of PEA-15. Group C was given magnetic stimulation and transfected with negative si RNA. Group D was treated with magnetic stimulation and si RNA transfection, which interfered with the expression of PEA-15. The healing of scratches was observed. Western Blot was used to observe the expression of PEA-15 and its protein phosphorylation, and the transfection efficiency was measured by fluorescence. Results 1. The astrocytes were isolated from the cortex of neonatal 1-3 day rats and separated by differential adhesion. 2. Cellular immunofluorescence was used to detect the purity of glial fibrillary acidic protein (GFAP) GFAP positive cells. 2. In vitro scratch test, it was found that the intensity of magnetic stimulation increased with the increase of magnetic stimulation intensity. The faster the scratch area healed, the more positive correlation was between the speed of astrocyte migration and the intensity of astrocyte migration under the maximum magnetic stimulation intensity of 30% to 60%. Compared with the control group, the difference was statistically significant (P 0.05). The fluorescence of the transfected cells indicated that the transfection reagent had a higher transfection efficiency, and the PEA-15 protein of the transfected cells was determined. Western Blot results suggest si. In the scratch test, the migration of P-PEA-15 in the transfected group and the magnetic stimulation group was significantly higher than that in the normal group, and the P-PEA-15 level in the magnetic stimulation group was significantly increased. Conclusion 1. High purity astrocytes. 2. In vitro scratch test. Magnetic stimulation of 30- 60% can significantly promote the migration of astrocytes. 3. Interfere with the expression of PEA-15 can significantly promote the migration of astrocytes. Magnetic stimulation may promote astrocyte migration through phosphorylation of PEA-15.
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R741

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本文編號：1373204