發(fā)布時間：2017-12-19 07:46

  本文關鍵詞：突觸囊泡蛋白2A在顳葉癲癇海馬區(qū)星形膠質細胞上的表達及功能研究

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【摘要】：背景顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy,TLE)是目前成人最常見的藥物難治性癲癇,發(fā)病機制不清。致癇灶內反應性星型膠質膠質細胞增生、肥大可能參與了顳葉癲癇發(fā)生過程,深入研究致癇灶內星型膠質細胞功能可能為癲癇治療帶來的策略。星形膠質細胞通過釋放膠質遞質可同步調節(jié)大量神經(jīng)元活動,類似于神經(jīng)遞質的量子化釋放,囊泡介導的胞吐過程是膠質遞質釋放的重要途徑,需要一系列分泌相關蛋白的參與。突觸囊泡蛋白2A(synaptic vesicle protein 2A,SV2A)是腦內突觸傳遞的重要正向調節(jié)蛋白,在囊泡胞吐和維持Ca2+穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用,目前研究發(fā)現(xiàn)新型抗癲癇藥物左乙拉西坦有可能通過SV2A介導抗癲癇作用,提示SV2A在癲癇發(fā)生過程中扮演重要角色,前期我課題組預實驗發(fā)現(xiàn)星型膠質細胞在病理狀態(tài)下表達SV2A,藉此我們提出假設:反應性星型膠質細胞表達SV2A促進了局部神經(jīng)回路興奮性增高,繼而介導慢性顳葉癲癇的形成。目的觀察SV2A在顳葉癲癇病人和動物模型海馬中的表達特征,以及在星型膠質細胞上的表達特點和超微結構,進而在離體水平探討SV2A參與活化狀態(tài)星形膠質細胞的促興奮機制。方法免疫組化染色觀察SV2A在顳葉癲癇患者海馬區(qū)和顳葉皮質中的表達變化。建立大鼠鋰-匹羅卡品模型,比較SE后24h、1w、4w、8w SV2A在海馬各區(qū)的分布特點及其m RNA和蛋白水平的變化。免疫熒光雙標檢測顳葉癲癇患者及動物模型SE后上述時點海馬星形膠質細胞上SV2A的表達特點,并通過免疫電鏡對SE后4w星形膠質細胞上的SV2A進行超微結構觀察。LPS干預原代培養(yǎng)的星形膠質細胞以模擬其在硬化海馬時的變化,于24h和48h后檢測SV2A的蛋白表達及分布;單獨給予星形膠質細胞胞內Ca2+動員劑ATP或聯(lián)合LPS干預后12h、24h觀察SV2A蛋白表達的變化;利用si-RNA干擾技術降低SV2A的表達后觀察Ca2+感受器突觸結合蛋白4(synaptotagmin4,Syt-4)m RNA的變化,以及LPS和LPS+ATP干預后Syt-4與SV2A m RNA水平的變化趨勢。結果(1)TLE-HS患者海馬區(qū)及顳葉皮質中陽性表達的SV2A明顯少于對照組(P0.05)。動物模型急性期(SE后24h)、潛伏期(SE后1w)、慢性期早期(SE后4w)海馬區(qū)SV2A m RNA和蛋白水平均低于對照組(P0.05);免疫組化顯示SE后1w、4w時SV2A在CA3區(qū)透明層和DG門區(qū)的分布明顯下降(P0.05)。(2)TLE-HS患者海馬區(qū)AST上SV2A的陽性表達率明顯高于對照組(P0.05)。大鼠對照組及SE后24h海馬AST上均未檢測出SV2A的表達,而SE后1w時部分AST上已出現(xiàn)SV2A的表達,至SE后4w、8w時可見增生肥大的AST,硬化海馬各區(qū)AST上均有SV2A的陽性表達;免疫電鏡示對照組AST上極少出現(xiàn)SV2A的表達,但SE后4w硬化海馬AST的胞漿及膠質絲上均有SV2A標記的銀染顆粒。(3)LPS活化AST 24h、48h后SV2A蛋白表達明顯增高(P0.05),免疫熒光顯示AST胞漿及突起上均有SV2A的廣泛分布;單獨給予ATP干預不影響SV2A的蛋白表達,但聯(lián)合LPS刺激24h后SV2A的蛋白表達明顯升高(P0.05)。si RNA干擾AST SV2A的表達可降低Syt-4 m RNA水平(P0.05);LPS單獨或聯(lián)合ATP干預后6h、12h、24h Syt-4與SV2A m RNA水平呈現(xiàn)一致性升高趨勢。結論TLE患者海馬和顳葉皮質標本中SV2A的表達降低,動物模型SE后各時點海馬區(qū)同樣發(fā)現(xiàn)了上述變化;SV2A的這種表達變化可能與SE后神經(jīng)元凋亡和正常突觸聯(lián)系受損有關。人腦標本和動物模型慢性期硬化海馬的AST上SV2A的表達異常增多,提示AST上的SV2A可能參與了癲癇發(fā)生的機制。ATP可升高活化狀態(tài)下AST上SV2A的表達;AST中SV2A的變化影響了Ca2+依賴性谷氨酸釋放通路關鍵分子Syt-4的表達。提示病理條件下AST中異常升高的SV2A可能通過調控Syt-4影響Ca2+依賴性谷氨酸遞質的釋放,進而參與癲癇發(fā)生中突觸重塑的過程。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R742.1

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本文編號：1307404