本文關(guān)鍵詞：突觸囊泡蛋白2A在顳葉癲癇海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá)及功能研究

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【摘要】：背景顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy,TLE)是目前成人最常見(jiàn)的藥物難治性癲癇,發(fā)病機(jī)制不清。致癇灶內(nèi)反應(yīng)性星型膠質(zhì)膠質(zhì)細(xì)胞增生、肥大可能參與了顳葉癲癇發(fā)生過(guò)程,深入研究致癇灶內(nèi)星型膠質(zhì)細(xì)胞功能可能為癲癇治療帶來(lái)的策略。星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)釋放膠質(zhì)遞質(zhì)可同步調(diào)節(jié)大量神經(jīng)元活動(dòng),類(lèi)似于神經(jīng)遞質(zhì)的量子化釋放,囊泡介導(dǎo)的胞吐過(guò)程是膠質(zhì)遞質(zhì)釋放的重要途徑,需要一系列分泌相關(guān)蛋白的參與。突觸囊泡蛋白2A(synaptic vesicle protein 2A,SV2A)是腦內(nèi)突觸傳遞的重要正向調(diào)節(jié)蛋白,在囊泡胞吐和維持Ca2+穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用,目前研究發(fā)現(xiàn)新型抗癲癇藥物左乙拉西坦有可能通過(guò)SV2A介導(dǎo)抗癲癇作用,提示SV2A在癲癇發(fā)生過(guò)程中扮演重要角色,前期我課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)星型膠質(zhì)細(xì)胞在病理狀態(tài)下表達(dá)SV2A,藉此我們提出假設(shè):反應(yīng)性星型膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)SV2A促進(jìn)了局部神經(jīng)回路興奮性增高,繼而介導(dǎo)慢性顳葉癲癇的形成。目的觀察SV2A在顳葉癲癇病人和動(dòng)物模型海馬中的表達(dá)特征,以及在星型膠質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá)特點(diǎn)和超微結(jié)構(gòu),進(jìn)而在離體水平探討SV2A參與活化狀態(tài)星形膠質(zhì)細(xì)胞的促興奮機(jī)制。方法免疫組化染色觀察SV2A在顳葉癲癇患者海馬區(qū)和顳葉皮質(zhì)中的表達(dá)變化。建立大鼠鋰-匹羅卡品模型,比較SE后24h、1w、4w、8w SV2A在海馬各區(qū)的分布特點(diǎn)及其m RNA和蛋白水平的變化。免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)顳葉癲癇患者及動(dòng)物模型SE后上述時(shí)點(diǎn)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞上SV2A的表達(dá)特點(diǎn),并通過(guò)免疫電鏡對(duì)SE后4w星形膠質(zhì)細(xì)胞上的SV2A進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察。LPS干預(yù)原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞以模擬其在硬化海馬時(shí)的變化,于24h和48h后檢測(cè)SV2A的蛋白表達(dá)及分布;單獨(dú)給予星形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+動(dòng)員劑ATP或聯(lián)合LPS干預(yù)后12h、24h觀察SV2A蛋白表達(dá)的變化;利用si-RNA干擾技術(shù)降低SV2A的表達(dá)后觀察Ca2+感受器突觸結(jié)合蛋白4(synaptotagmin4,Syt-4)m RNA的變化,以及LPS和LPS+ATP干預(yù)后Syt-4與SV2A m RNA水平的變化趨勢(shì)。結(jié)果(1)TLE-HS患者海馬區(qū)及顳葉皮質(zhì)中陽(yáng)性表達(dá)的SV2A明顯少于對(duì)照組(P0.05)。動(dòng)物模型急性期(SE后24h)、潛伏期(SE后1w)、慢性期早期(SE后4w)海馬區(qū)SV2A m RNA和蛋白水平均低于對(duì)照組(P0.05);免疫組化顯示SE后1w、4w時(shí)SV2A在CA3區(qū)透明層和DG門(mén)區(qū)的分布明顯下降(P0.05)。(2)TLE-HS患者海馬區(qū)AST上SV2A的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組(P0.05)。大鼠對(duì)照組及SE后24h海馬AST上均未檢測(cè)出SV2A的表達(dá),而SE后1w時(shí)部分AST上已出現(xiàn)SV2A的表達(dá),至SE后4w、8w時(shí)可見(jiàn)增生肥大的AST,硬化海馬各區(qū)AST上均有SV2A的陽(yáng)性表達(dá);免疫電鏡示對(duì)照組AST上極少出現(xiàn)SV2A的表達(dá),但SE后4w硬化海馬AST的胞漿及膠質(zhì)絲上均有SV2A標(biāo)記的銀染顆粒。(3)LPS活化AST 24h、48h后SV2A蛋白表達(dá)明顯增高(P0.05),免疫熒光顯示AST胞漿及突起上均有SV2A的廣泛分布;單獨(dú)給予ATP干預(yù)不影響SV2A的蛋白表達(dá),但聯(lián)合LPS刺激24h后SV2A的蛋白表達(dá)明顯升高(P0.05)。si RNA干擾AST SV2A的表達(dá)可降低Syt-4 m RNA水平(P0.05);LPS單獨(dú)或聯(lián)合ATP干預(yù)后6h、12h、24h Syt-4與SV2A m RNA水平呈現(xiàn)一致性升高趨勢(shì)。結(jié)論TLE患者海馬和顳葉皮質(zhì)標(biāo)本中SV2A的表達(dá)降低,動(dòng)物模型SE后各時(shí)點(diǎn)海馬區(qū)同樣發(fā)現(xiàn)了上述變化;SV2A的這種表達(dá)變化可能與SE后神經(jīng)元凋亡和正常突觸聯(lián)系受損有關(guān)。人腦標(biāo)本和動(dòng)物模型慢性期硬化海馬的AST上SV2A的表達(dá)異常增多,提示AST上的SV2A可能參與了癲癇發(fā)生的機(jī)制。ATP可升高活化狀態(tài)下AST上SV2A的表達(dá);AST中SV2A的變化影響了Ca2+依賴(lài)性谷氨酸釋放通路關(guān)鍵分子Syt-4的表達(dá)。提示病理?xiàng)l件下AST中異常升高的SV2A可能通過(guò)調(diào)控Syt-4影響Ca2+依賴(lài)性谷氨酸遞質(zhì)的釋放,進(jìn)而參與癲癇發(fā)生中突觸重塑的過(guò)程。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R742.1

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