本文關(guān)鍵詞：微小RNA miR-21轉(zhuǎn)基因治療促進皮膚創(chuàng)面愈合的實驗研究

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【摘要】：創(chuàng)傷愈合既是生物醫(yī)學領(lǐng)域最古老的，同時也是現(xiàn)代醫(yī)學不可回避的重要之一。從分子水平研究皮膚創(chuàng)傷發(fā)生、發(fā)展的過程，已使皮膚創(chuàng)傷研究提高到一個前所未有的水平。一系列生長因子、相關(guān)信號通路和功能蛋白的研究既從分子水平上深化了我們對于創(chuàng)傷機理的認識，又為促進創(chuàng)傷愈合提供了許多新的治療手段和藥物。近年來，一類參與基因表達轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要分子——微小RNA（microRNAs，miRNAs）在多種生物學事件中的作用逐漸被揭示，其在皮膚創(chuàng)傷修復中的作用也越來越受到重視。我們和其他學者的研究表明，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的癌基因miR-21在小鼠皮膚創(chuàng)傷后表達上調(diào)顯著，在創(chuàng)面局部抑制這種上調(diào)可以削弱修復、延緩愈合，提示miR-21是皮膚促愈的潛在靶點。然而，又有學者報道，miR-21在靜脈曲張性難愈性潰瘍也呈現(xiàn)高表達，以其模擬物干預(yù)大鼠急性創(chuàng)面認為其抑制愈合。創(chuàng)面過表達miR-21到底會對愈合產(chǎn)生何種影響？ miR-21是否為皮膚促愈的潛在靶點？為了明確這些問題，本課題分為以下三個部分進行研究： 1．pRc/CMV-miR-21真核表達載體構(gòu)建及其生物活性鑒定。PCR擴增長度約為390bp含有pre-miR-21的小鼠基因組DNA序列，產(chǎn)物經(jīng)Hind Ⅲ和XbaⅠ雙酶切后純化回收，連接到pRc/CMV空質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌后涂板，挑取克隆經(jīng)菌液PCR、酶切鑒定和測序分析獲得pRc/CMV-miR-21陽性克隆。同時構(gòu)建miR-21的熒光素酶報告質(zhì)粒，將含有與miR-21分子完全互補的寡核苷酸序列插入到pMIR-Reporter質(zhì)粒中熒光素酶基因的3′UTR，經(jīng)酶切、測序證實獲得pmiR-21-Luc reporter熒光素酶報告質(zhì)粒。pRc/CMV-miR-21質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細胞經(jīng)G418篩選后獲得穩(wěn)定表達的陽性克隆，經(jīng)Northern blot檢測具有成熟miR-21的陽性信號。共轉(zhuǎn)染pmiR-21-Luc reporte與pRc/CMV-miR-21，可以有效降低pmiR-21-Luc reporte報告質(zhì)粒的熒光素酶活性，表明pRc/CMV-miR-21的產(chǎn)物具有生物活性。 2．皮膚創(chuàng)緣注射pEGFP-N1報告基因裸質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因干預(yù)創(chuàng)傷愈合小鼠模型的建立。以pEGFP-N1為報告基因質(zhì)粒，在小鼠皮膚創(chuàng)緣周圍分三點皮下注射pEGFP-N1裸質(zhì)粒，然后觀察EGPF蛋白在小鼠創(chuàng)面愈合中的表達定位及其強度變化的規(guī)律，以此間接確定mir-21真核質(zhì)粒在干預(yù)后的皮膚創(chuàng)面修復中的表達特點。不同時相點創(chuàng)面組織的GFP免疫組化結(jié)果表明：GFP陽性細胞主要定位于新生肉芽組織，其陽性比例在傷后早期很低，隨修復進行到第7d和10d最高，到修復末期（15d）又明顯降低。表明裸質(zhì)粒表達產(chǎn)物高峰期與創(chuàng)面修復關(guān)鍵期吻合，，而愈合后表達明顯降低，具有自限性，能夠有效干預(yù)創(chuàng)面修復。進一步以pRc/CMV-miR-21裸質(zhì)粒注射到小鼠創(chuàng)面，通過原位雜交的方法半定量的分析miR-21的表達強度，證實了本方法可以有效提高修復期新生肉芽中miR-21的表達。為后續(xù)功能研究建立了一種簡單、易行、有效的小鼠創(chuàng)面修復的轉(zhuǎn)基因治療模型。 3．miR-21轉(zhuǎn)基因治療促進小鼠皮膚創(chuàng)傷愈合的實驗研究。以正常小鼠和自制Ⅱ型糖尿病小鼠的皮膚創(chuàng)面為模型，創(chuàng)緣周圍分三點注射pRcCMV-miR-21真核載體表達質(zhì)粒（實驗組）和pRc/CMV空白質(zhì)粒（對照組）。注射后不同時相點大體觀察皮膚創(chuàng)面愈合情況，同時測定殘留面積和創(chuàng)面愈合時間。各個時相點取材進行病理學觀察，HE染色觀察創(chuàng)面病理變化，Ki67免疫組化觀察肉芽組織間細胞的增殖活性，Masson染色觀察致傷30d后皮膚瘢痕的修復情況。結(jié)果表示，在正常創(chuàng)面和難愈性創(chuàng)面的大體觀察中，實驗組均比對照組愈合速度快，約提前2.5d。致傷后7d的HE病理切片也顯示，治療組較對照組肉芽組織向中心區(qū)域遷移更快，新生肉芽面積更大，但Ki67免疫組化顯示兩組肉芽間質(zhì)中陽性細胞比例相當。同時發(fā)現(xiàn)，傷后7d治療組較對照組再上皮化明顯較快。在致傷30d后的Masson染色結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)兩組的膠原沉積均沒有異常增多，表明miR-21轉(zhuǎn)基因治療沒有影響到重塑后期膠原沉積。
【關(guān)鍵詞】：miR-21 皮膚 創(chuàng)面修復 裸質(zhì)粒
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R641
【目錄】：

• 縮略語表5-6
• Abstract6-8
• 摘要8-10
• 第一章 前言10-12
• 第二章 PRC/CMV-MIR-21 真核表達載體構(gòu)建及其生物活性鑒定12-32
• 2.1 材料和方法12-16
• 2.2 實驗方法16-26
• 2.3 結(jié)果26-29
• 2.4 討論29-31
• 2.5 小結(jié)31-32
• 第三章 皮膚創(chuàng)緣注射PEGFP-N1 裸質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因干預(yù)創(chuàng)傷愈合小鼠模型的建立32-45
• 3.1 材料和方法32-33
• 3.2 實驗方法33-39
• 3.3 結(jié)果39-43
• 3.4 討論43-44
• 3.5 小結(jié)44-45
• 第四章 PRC/CMV-MIR-21 裸質(zhì)粒創(chuàng)緣注射轉(zhuǎn)基因治療促進小鼠皮膚創(chuàng)傷愈合的實驗研究45-64
• 4.1 材料和方法45-47
• 4.2 實驗方法47-50
• 4.3 結(jié)果50-60
• 4.4 討論60-63
• 4.5 小結(jié)63-64
• 全文總結(jié)64-65
• 1. 成功構(gòu)建 pRc/CMV-miR-21 真核表達載體并驗證其生物活性64
• 2. 在皮膚創(chuàng)緣注射 pEGFP-N1 裸質(zhì)粒成功建立轉(zhuǎn)基因干預(yù)創(chuàng)面修復的小鼠模型64
• 3. miR-21 轉(zhuǎn)基因治療能促進小鼠皮膚創(chuàng)傷愈合64-65
• 參考文獻65-71
• 文獻綜述71-80
• 參考文獻77-80
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文80-81
• 致謝81

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本文編號：982470