本文關(guān)鍵詞：TGF-β3在機(jī)械牽拉誘導(dǎo)體外肌腱干細(xì)胞分化中的作用研究

  更多相關(guān)文章： 肌腱干細(xì)胞 分化 機(jī)械牽拉 TGF-β3

【摘要】：肌腱病是由過度牽拉引起肌腱微損傷所致,其主要病理表現(xiàn)為肌腱組織的異位骨化和脂肪組織形成。肌腱細(xì)胞是肌腱微損傷修復(fù)的主要功能細(xì)胞,但它們是終末細(xì)胞無分化潛能;肌腱干細(xì)胞(TSCs,tendon stem cells)是肌腱細(xì)胞的唯一前體細(xì)胞,且分化能力強(qiáng),具有多向分化潛能,TSCs對(duì)肌腱微損傷修復(fù)可能起到?jīng)Q定性作用。課題組之前的研究發(fā)現(xiàn),在肌腱微損傷的修復(fù)過程中,“適度”牽拉可能導(dǎo)致TSCs向成肌腱分化有利于肌腱微損傷修復(fù),“過度”牽拉可導(dǎo)致TSCs成骨、成脂分化,加重肌腱損傷導(dǎo)致修復(fù)失敗。TGF-β3作為TGF-β超家族的成員,廣泛存在于各種組織中,文獻(xiàn)報(bào)道其對(duì)于多種干細(xì)胞的分化有不同的作用且具有機(jī)械敏感性,然而它在TSCs分化中是否發(fā)揮作用以及作用的機(jī)制尚不清楚。本課題分別探索機(jī)械牽拉對(duì)TSCs分化及TGF-β3表達(dá)的影響,TGF-β3對(duì)TSCs分化的影響,并最終明確TGF-β3在機(jī)械牽拉誘導(dǎo)的TSCs分化中的作用。第一部分不同強(qiáng)度的機(jī)械牽拉誘導(dǎo)肌腱干細(xì)胞分化及TGF-β3表達(dá)的影響TSCs具有多向分化潛力,且可受機(jī)械牽拉影響而分化。第一部分實(shí)驗(yàn)將通過不同強(qiáng)度機(jī)械牽拉體外培養(yǎng)的TSCs,明確導(dǎo)致TSCs“正�！焙汀爱惓！狈只牧W(xué)條件,以及機(jī)械牽拉對(duì)TGF-β3表達(dá)的影響。一、實(shí)驗(yàn)方法1.TSCs的分離培養(yǎng)和鑒定取3周齡雄性SD大鼠跟腱,使用酶消化法提取原代細(xì)胞。在細(xì)胞融合達(dá)到90%時(shí)進(jìn)行傳代,取P3代用于實(shí)驗(yàn)。2.細(xì)胞牽拉實(shí)驗(yàn)P3代細(xì)胞接種于硅膠培養(yǎng)皿。使用4%、8%牽拉強(qiáng)度以及1Hz牽拉頻率牽拉TSCs,在牽拉的第12h、24h、36h、48h收集細(xì)胞用于檢測(cè)。同時(shí)接種同批次細(xì)胞于硅膠培養(yǎng)皿作為對(duì)照組。3.細(xì)胞分化方向檢測(cè)PCR檢測(cè)成肌腱分化標(biāo)志性基因I型膠原(Collagen Type I,Col I),TNC,TNMD,Scx;成骨分化標(biāo)志性基因Runx2;成軟骨分化標(biāo)志性基因Sox9;成脂肪分化標(biāo)志性基因PPARγ的轉(zhuǎn)錄水平以確定細(xì)胞分化方向。并確定成肌腱和成骨的牽拉條件。4.TGF-β3表達(dá)變化的檢測(cè)以不牽拉組為對(duì)照組,PCR檢測(cè)TGF-β3的轉(zhuǎn)錄水平。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.機(jī)械牽拉對(duì)TSCs分化的影響4%和1Hz條件下牽拉細(xì)胞24-36小時(shí),成肌腱分化標(biāo)志性基因Col I,TNC,TNMD和Scx的m RNA轉(zhuǎn)錄水平分別為對(duì)照組的2.50±10.7,4.12±1.46,2.56±0.07,1.41±0.34倍。成軟骨標(biāo)志性基因Sox9及成脂標(biāo)志性基因PPARγ的m RNA轉(zhuǎn)錄水平分別為對(duì)照組的0.49±0.25,0.53±0.19倍。8%和1Hz牽拉細(xì)胞24小時(shí),成肌腱分化標(biāo)志性基因Col I,TNMD的m RNA轉(zhuǎn)錄水平分別為對(duì)照組的1.84±0.53,2.22±0.45倍,之后出現(xiàn)下降。在牽拉第24-36小時(shí),成骨標(biāo)志性基因Runx2,成軟骨標(biāo)志性基因Sox9和成脂標(biāo)志性基因PPARγ的m RNA轉(zhuǎn)錄水平分別為對(duì)照組的2.42±0.43,2.78±0.85,3.33±1.17倍。牽拉12-48小時(shí),TGF-β3的轉(zhuǎn)錄水平為對(duì)照組的2.53-4.71倍。2.機(jī)械牽拉對(duì)TGF-β3表達(dá)量的影響4%,1Hz條件下牽拉12-48小時(shí),TGF-β3的轉(zhuǎn)錄水平為對(duì)照組的1.69-3.24倍;8%,1Hz條件下牽拉12-48小時(shí),TGF-β3的轉(zhuǎn)錄水平為對(duì)照組的2.53-4.71倍。三、小結(jié)1.4%機(jī)械牽拉36小時(shí)可以促進(jìn)成肌腱標(biāo)志基因的表達(dá),并抑制成脂相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)。2.8%機(jī)械牽拉24-36小時(shí)可以促進(jìn)成肌腱標(biāo)志基因的表達(dá)的同時(shí),啟動(dòng)成軟骨、成骨、成脂等異常分化。3.在4%和8%體外機(jī)械牽拉均可誘導(dǎo)TSCs TGF-β3表達(dá)升高,8%較4%的牽拉強(qiáng)度,在相同時(shí)間TGF-β3升高倍數(shù)更高。第二部分不同濃度的TGF-β3對(duì)體外肌腱干細(xì)胞分化的影響根據(jù)第一部分結(jié)果,對(duì)體外培養(yǎng)TSCs予以TGF-β3處理,最終明確其在TSCs分化中的作用。一、實(shí)驗(yàn)方法取P3代TSCs接種于普通培養(yǎng)皿中,使用終濃度為1ng/ml,2.5ng/ml,5ng/ml的TGF-beta3處理,在處理1、3、5天后收集細(xì)胞,PCR檢測(cè)分化相關(guān)基因的表達(dá)情況。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.TGF-β3濃度在2.5-5ng/ml,處理3-5天時(shí),成肌腱分化標(biāo)志物Col I、TNC、TNMD、Scx轉(zhuǎn)錄水平分別為對(duì)照組的1.49-1.85、1.57-3.03、1.53-3.65和1.65-2.29倍,隨濃度和處理時(shí)間的增加而增加。2.在TGF-β3濃度為1-2.5ng/ml,處理第1天,成軟骨分化標(biāo)志物Sox9為對(duì)照組的0.34-0.73倍;TGF-β3濃度為2.5-5ng/ml,處理第5天時(shí),成軟骨分化標(biāo)志物Sox9和Col II分別為對(duì)照組的1.38-1.40和1.44倍。3.在TGF-β3濃度為1-2.5ng/ml,處理第1天,成骨分化標(biāo)志物Rux-2為對(duì)照組的0.54-0.56倍;TGF-β3濃度為2.5-5ng/ml,處理第5天時(shí),成骨分化標(biāo)志物Rux-2和ALP為對(duì)照組的2.60,1.93-2.42倍。4.隨TGF-β3濃度和時(shí)間變化,成脂分化標(biāo)志物PPARγ表達(dá)量分別為對(duì)照組的0.36-0.68倍,TGF-β3濃度為1-5ng/ml,處理第5天,成脂分化標(biāo)志物AP2的表達(dá)量為對(duì)照組的1.59-2.63倍。三、小結(jié)TGF-β3單一因素隨處理濃度和時(shí)間的改變可對(duì)TSCs的分化表現(xiàn)出不同作用,與不同條件牽拉對(duì)肌腱干細(xì)胞作用的情況部分類似。TGF-β3促進(jìn)TSCs向肌腱方向分化,與TGF-β3的濃度、處理時(shí)間均呈顯著性相關(guān),且兩者存在交互作用(P0.05)。TGF-β3短時(shí)間、低濃度刺激會(huì)促進(jìn)TSCs向成肌腱方向分化,并抑制TSCs的成脂、成骨及成軟骨等非肌腱方向分化,而高濃度、長(zhǎng)時(shí)間刺激會(huì)同時(shí)導(dǎo)致TSCs向成骨、成軟骨等方向分化。TGF-β3可能是機(jī)械牽拉導(dǎo)致肌腱干細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素。第三部分TGF-β3在機(jī)械牽拉誘導(dǎo)體外肌腱干細(xì)胞分化中的作用研究在體外機(jī)械循環(huán)牽拉TCSs的同時(shí),使用兩種TGF-β受體抑制劑SB431542和LY2109761處理細(xì)胞,阻斷其TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路,以觀察其在機(jī)械牽拉中的作用。一、實(shí)驗(yàn)方法取P3代TSCs接種于硅膠培養(yǎng)皿中,分別使用終濃度為2n M的SB431542和LY2109761處理處理細(xì)胞并予以4%或8%的強(qiáng)度,牽拉30小時(shí),觀察其分化情況。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果在4%牽拉的條件,使用TGF-β受體抑制劑的情況下,成肌腱標(biāo)志基因Col I,TNC,Scx的m RNA轉(zhuǎn)錄水平及TNC和Scx蛋白的表達(dá)量均較牽拉組降低。在8%牽拉的條件,使用TGF-β受體抑制劑的情況下,成骨標(biāo)志基因Runx2和ALP的m RNA轉(zhuǎn)錄水平與牽拉組無明顯差異,Runx2蛋白表達(dá)量抑制劑組較牽拉組升高。成軟骨分化標(biāo)志性基因Sox9的m RNA轉(zhuǎn)錄水平抑制劑組較牽拉組降低,但其蛋白表達(dá)量無顯著性差異。成脂分化標(biāo)志性基因AP2的m RNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)抑制劑組較牽拉組降低。三、小結(jié)TGF-β3在機(jī)械牽拉誘導(dǎo)的TSCs向成肌腱方向分化中起到重要作用,在機(jī)械牽拉誘導(dǎo)的TSCs向成骨方向分化中可能起抑制作用。TGF-β3在機(jī)械牽拉誘導(dǎo)的TSCs成脂方向分化中不單獨(dú)起作用,不參與機(jī)械牽拉誘導(dǎo)的TSCs向成軟骨方向分化。全文總結(jié):1.機(jī)械牽拉誘導(dǎo)TGF-β3表達(dá)上調(diào)。2.使用不同濃度的TGF-β3處理不同時(shí)間,可誘導(dǎo)TSCs向不同方向分化。3.TSCs在受機(jī)械牽拉誘導(dǎo)分化的過程中,細(xì)胞生長(zhǎng)因子的旁分泌起了重要作用。其中,TGF-β在機(jī)械牽拉誘導(dǎo)的TSCs向成肌腱方向分化中起到重要作用,并抑制機(jī)械牽拉誘導(dǎo)的TSCs向成骨方向分化。
【關(guān)鍵詞】：肌腱干細(xì)胞 分化 機(jī)械牽拉 TGF-β3
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R686.1
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-7
• 英文摘要7-11
• 中文摘要11-15
• 第一章 前言15-18
• 1.1 選題緣由15
• 1.2 研究背景15-16
• 1.3 研究意義16
• 1.4 研究?jī)?nèi)容16-17
• 1.5 研究方法17-18
• 第二章 不同強(qiáng)度的機(jī)械牽拉對(duì)肌腱干細(xì)胞分化及TGF-β3 表達(dá)的影響18-30
• 2.1 材料與方法19-22
• 2.2 結(jié)果22-27
• 2.3 討論27-29
• 2.4 小結(jié)29-30
• 第三章 不同濃度的TGF-β3 對(duì)體外肌腱干細(xì)胞分化的影響30-42
• 3.1 材料與方法30-34
• 3.2 結(jié)果34-39
• 3.3 討論39-40
• 3.4 小結(jié)40-42
• 第四章 TGF-β3 在機(jī)械牽拉誘導(dǎo)體外肌腱干細(xì)胞分化中的作用機(jī)制初步研究42-55
• 4.1 材料與方法42-48
• 4.2 結(jié)果48-52
• 4.3 討論52-54
• 4.4 小結(jié)54-55
• 全文總結(jié)55-56
• 參考文獻(xiàn)56-64
• 文獻(xiàn)綜述TGF-β 超家族信號(hào)通路的傳導(dǎo)途徑、調(diào)控及對(duì)細(xì)胞分化的影響64-84
• 參考文獻(xiàn)70-84
• 攻讀碩士學(xué)位期間的研究成果84-85
• 致謝85

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本文編號(hào)：881091