本文關(guān)鍵詞：富血小板血漿對糖尿病大鼠創(chuàng)面巨噬細胞浸潤變化的影響

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【摘要】：研究背景 隨著糖尿病發(fā)病率的增高,糖尿病創(chuàng)面愈合的困難已逐漸成為創(chuàng)面研究領(lǐng)域內(nèi)的熱點及難點。關(guān)于糖尿病創(chuàng)面愈合障礙的機制,至今尚未完全闡明。研究表明巨噬細胞的表型及炎癥反應(yīng)功能可受糖尿病狀態(tài)的影響,糖尿病創(chuàng)面內(nèi)也常常伴有異常的巨噬細胞炎癥反應(yīng)狀態(tài)。關(guān)于糖尿病創(chuàng)面的巨噬細胞浸潤異常既往已有部分研究涉及,但糖尿病創(chuàng)面愈合過程中不同階段巨噬細胞的浸潤變化情況及炎癥反應(yīng)能力尚未完全闡明。臨床研究表明,富血小板血漿(Platelet-rich plasma,PRP)對糖尿病創(chuàng)面的愈合具有較強的促進作用,但具體作用機制尚不明確。通常PRP被用作生長因子的載體應(yīng)用于創(chuàng)面治療,但作為血漿和血小板的混合物,PRP對創(chuàng)面愈合的促進作用遠不止提供生長因子。研究顯示富血小板血漿中含有大量的抗炎癥及促炎癥物質(zhì),對關(guān)節(jié)炎等炎癥性疾病具有較強的控制炎癥作用,并且PRP中的主要成分血小板也是炎癥及免疫調(diào)節(jié)的中樞,對巨噬細胞具有較強的調(diào)節(jié)作用。因此我們提出假設(shè)：富血小板血漿對糖尿病創(chuàng)面的愈合促進作用并不局限于提供充足的生長因子,還與調(diào)節(jié)了糖尿病創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)及巨噬細胞功能有關(guān)。 研究目的 采用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠創(chuàng)面為模型觀察糖尿病創(chuàng)面巨噬細胞的浸潤變化及富血小板血漿對巨噬細胞浸潤變化的影響。 研究方法 1.糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合過程中巨噬細胞的浸潤變化 以雄性SD大鼠為實驗動物,糖尿病組采用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)形成,健康SD大鼠為對照組,每組15只。在大鼠背部形成面積為1cm2為全層皮膚缺損,分別于術(shù)后第3、7、14天觀察并比較創(chuàng)面的愈合率,同時觀察創(chuàng)面組織中CD68+巨噬細胞浸潤數(shù)量的差異,IL-12B、iNOS、TNF-α的mRNA相對表達量的差異以及創(chuàng)面組織中M1型巨噬細胞CCR7陽性染色的變化。 2.富血小板血漿對糖尿病大鼠創(chuàng)面巨噬細胞浸潤變化的影響 以雄性SD大鼠為實驗動物,采用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)造成糖尿病模型,隨機分為實驗組(非激活PRP組和激活PRP組)以及對照組(生理鹽水組),每組各15只。在大鼠背部形成面積為1cm2為全層皮膚缺損,分別涂以非激活PRP、激活PRP、生理鹽水0.1ml/創(chuàng)面。于術(shù)后第3、7、14天觀察并比較創(chuàng)面的愈合率,同時觀察創(chuàng)面組織中CD68+巨噬細胞的浸潤數(shù)量,炎癥因子IL-12B、TNF-a及抗炎癥因子IL-10mRNA的相對表達量,同時采用體外趨化實驗觀察PRP對糖尿病大鼠腹腔巨噬細胞的趨化作用,并采用免疫熒光染色法觀察共培養(yǎng)條件下巨噬細胞CCR7(M1型巨噬細胞)和CD206(M2型巨噬細胞)的表達情況。 研究結(jié)果 1.糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合過程中巨噬細胞的浸潤變化 術(shù)后第3、7、14天時糖尿病大鼠的創(chuàng)面愈合率均低于健康對照組(p0.05)。HE染色顯示第3天時糖尿病組創(chuàng)面組織內(nèi)的炎癥細胞浸潤數(shù)量低于健康對照組大鼠,而第14天時高于健康對照組；CD68免疫組化染色顯示第3天時糖尿病組大鼠創(chuàng)面組織內(nèi)巨噬細胞的浸潤數(shù)量低于健康對照大鼠組(p0.01),而第14天時則明顯高于健康對照組(p0.01)；相關(guān)性分析顯示第三天時創(chuàng)面巨噬細胞數(shù)和創(chuàng)面愈合率呈正相關(guān)(r=0.909,p0.01),第14天時兩者間呈負相關(guān)(r=-0.962,p0.01)。糖尿病組創(chuàng)面組織中IL-12B、iNOS、TNF-α的mRNA表達量術(shù)后第3天時較健康對照組降低(p0.05),而第14天時較健康對照組升高(p0.05)。創(chuàng)面組織CCR7熒光染色顯示第14天時仍有較多陽染細胞殘留于糖尿病組創(chuàng)面組織內(nèi)。2.富血小板血漿對糖尿病大鼠創(chuàng)面巨噬細胞浸潤變化的影響 在術(shù)后第3、7、14天時,實驗組的創(chuàng)面愈合率均高于對照組p0.05。其中第3天時激活PRP組明顯愈合率明顯低于非激活PRP組,p0.01。而第7和第14天時,激活PRP組創(chuàng)面愈合率高于非激活PRP組,但兩者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。HE染色結(jié)果顯示術(shù)后第3、7、14天時,實驗組創(chuàng)面組內(nèi)均可見到較多炎癥細胞浸潤,其中非激活PRP組更為明顯。CD68染色結(jié)果顯示術(shù)后第3、7、14天時實驗組創(chuàng)面中平均每個高倍視野下巨噬數(shù)量比對照組增高,p0.01,且非激活PRP組較激活PRP組明顯,p0.01。對創(chuàng)面組織mRNA的檢測結(jié)果顯示：術(shù)后第3天和第14天時,激活PRP和非激活PRP組創(chuàng)面中炎癥因子IL-12B和TNF—α的mRNA表達均較對照組明顯下降。兩實驗組均可有效促進創(chuàng)面抗炎癥因子IL-10的表達,其中激活PRP組在術(shù)后第7、14天時表達量超過非激活PRP組。體外趨化實驗顯示在體外高糖培養(yǎng)環(huán)境中,PRP對靜息腹腔巨噬具有明顯的趨化作用,其中非激活PRP的趨化指數(shù)除了在10%濃度點低于激活PRP組外,其余濃度點的趨化指數(shù)均較激活PRP高,p0.05。體外共培養(yǎng)后對巨噬細胞爬片的熒光染色結(jié)果顯示,PRP可以改變促進巨噬細胞CD206(M2型)的表達,其中激活PRP的作用更為明顯。 研究結(jié)論 糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合過程中巨噬細胞早期進入創(chuàng)面的數(shù)量減少,而晚期則持續(xù)停留于創(chuàng)面,并且伴有早期減弱晚期增強的炎癥反應(yīng)。PRP可以有效促進糖尿病創(chuàng)面的愈合,趨化巨噬細胞在局部的浸潤,并抑制創(chuàng)面炎癥因子的表達,促進抗炎癥因子的表達,其機制可能與富血小板血漿可以促進糖尿病巨噬細胞向促血管型(M2型)巨噬細胞分化有關(guān),其中激活PRP的作用更為明顯。
【關(guān)鍵詞】：糖尿病創(chuàng)面 創(chuàng)面愈合 巨噬細胞 炎癥反應(yīng) 富血小板血漿
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R587.1;R641
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 第一部分 糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合過程中巨噬細胞的浸潤變化11-33
• 前言11-13
• 實驗材料及方法13-21
• 結(jié)果21-26
• 討論26-30
• 參考文獻30-33
• 第二部分 富血小板血漿對糖尿病大鼠創(chuàng)面巨噬細胞浸潤變化的影響33-54
• 前言33-36
• 實驗材料及方法36-42
• 結(jié)果42-47
• 討論47-50
• 參考文獻50-54
• 全文總結(jié)54-55
• 文獻綜述55-67
• 參考文獻63-67
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文67-68
• 致謝68-69

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