本文關鍵詞：人臍帶沃頓膠間充質干細胞移植治療對大鼠腦損傷區(qū)微循環(huán)的影響

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【摘要】：背景 創(chuàng)傷性顱腦損傷（traumatic brain injury, TBI）是神經(jīng)外科最常見的疾病之一，隨著社會經(jīng)濟的飛快發(fā)展，跌落傷、交通傷、以及暴力傷等引起的TBI患者也同比增加。TBI的幸存者大部分都留下了不同程度的神經(jīng)心理疾病及肢體運動感覺障礙等，影響了他們的工作、生活以及社會活動，他們一般都要進行長時間的康復治療，并且需要陪護，這就浪費了大量的社會資源。微循環(huán)的主要功能是進行物質交換，以及通過微動脈阻力的變化控制組織器官血流量的大小，可是微循環(huán)的血管的舒縮活動的控制主要與局部的代謝活動有關，，因此局部代謝的變化會造成微循環(huán)的障礙，進一步導致器官的生理功能受到影響。創(chuàng)傷性顱腦損傷出現(xiàn)的腦微循環(huán)的障礙是該病極為重要的病理生理學變化，是繼發(fā)性損害的關鍵環(huán)節(jié)，也是疾病轉歸和影響神經(jīng)功能恢復的關鍵因素。防治創(chuàng)傷性顱腦外傷后的腦微循環(huán)障礙是神經(jīng)外科重點關注的領域之一。 有研究證實骨髓間充質干細胞移植治療骨缺損時分泌血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可以促進新生血管生成，但是對于創(chuàng)傷性顱腦損傷損傷區(qū)微循環(huán)的影響尚未可知，并且骨髓間充質干細胞由于取材不便、細胞數(shù)量受年齡限制等原因限制了應用前景。人臍帶沃頓膠間充質干細胞（mesenchymal stromal cells derived from Wharton’s jelly cells, WJCs）具有來源廣泛，且較其它間充質干細胞易于分離培養(yǎng)、能夠大量獲取、且增殖分化能力較強等優(yōu)點。人臍帶沃頓膠間充質干細胞可以通過促進各種營養(yǎng)因子的分泌對受損的神經(jīng)系統(tǒng)起到保護及治療作用。目前尚沒有關于人臍帶沃頓膠間充質干細胞移植后對腦損傷區(qū)域的腦微循環(huán)變化的研究，本研究將致力于人臍帶沃頓膠間充質干細胞移植對腦損傷區(qū)微循環(huán)的影響。 近年來，功能磁共振成像技術取得了飛速的發(fā)展，除了能顯示的形態(tài)結構學信息，還可以反映腦損傷后代謝、生理等方面的功能改變的信息。磁共振灌注成像（perfusion-weighted imaging, PWI)，常采用單次激發(fā)的平面回波自由感應衰減(echo planar imaging of free induction decay, EPI-FID)序列，注入的造影劑到達腦組織感興趣區(qū)，使局部磁場改變而獲得信號。PWI能夠檢出局部組織的血流灌注情況，并且可以分析血流動力學的改變以及功能的變化，并能根據(jù)需要重點反映組織的微血管分布以及血流灌注的情況。 目的 觀察人臍帶沃頓膠間充質干細胞移植對SD大鼠腦損傷區(qū)域的微循環(huán)變化的影響，探討微循環(huán)變化對損傷區(qū)腦組織的保護及修復作用。 材料與方法 1.實驗動物：SPF級雄性SD大鼠72只(8周齡，體重250~300g)由河南省實驗動物中心提供。跟據(jù)國家發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》，對實驗動物進行適宜的安置。讓大鼠自由的攝食與飲水,室溫始終控制在(23±2)℃，相對濕度控制在40%-60%。 2.細胞的分離與培養(yǎng)：離體的臍帶由健康足月剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦志愿捐獻，由鄭州大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，無菌環(huán)境下取臍帶一段，剝離臍帶外膜，將沃頓膠組織剪碎后放置于含有bFGF（20μg/L）和FBS（10%）的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在含有CO2（5%）的37攝氏度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)及傳代。取傳代至P3代的人臍帶沃頓膠間充質干細胞進行鏡下觀察及流式細胞儀檢測。 3.TBI模型的制作及分組:模型的建立采用Feeney的自由落體撞擊法，根據(jù)相關文獻建立大鼠中度創(chuàng)傷性顱腦損傷模型。72只SD大鼠被隨機分為4組：依次為假手術組（A組），切開頭部皮膚，顱骨鉆孔后不損傷腦組織不移植細胞；移植對照組（B組），制作中度創(chuàng)傷性顱腦損傷模型成功后經(jīng)股靜脈靜脈注射0.3ml生理鹽水；WJCs移植組（C組），制作中度創(chuàng)傷性顱腦損傷模型成功后經(jīng)股靜脈靜脈注射WJCs混懸液0.3ml；正常組（D組），無任何損傷及干預措施。 4. PWI序列掃描：采用美國GE公司Discovery MR7503.0T高場強磁共振儀和大鼠專用線圈，各組大鼠均進行橫軸位T1加權成像（T1-weighted imaging,T1WI）和T2加權成像（T2-weighted imaging, T2WI）、矢狀位T2WI、冠狀位T2WI及PWI的掃描。根據(jù)橫軸位T2WI掃描圖像為參考，觀察大鼠腦外傷后損傷灶周圍皮質、丘腦、海馬及對側相應部位在磁共振圖像上隨時間的變化情況，并記錄相應時間點相應部位腦組織的參數(shù)包括CBF和CBV。計算上述指標的相對值(傷側/健側)，分別得到rCBF和rCBV，盡可能降低個體差異所引起的誤差。比較實驗組與對照組大鼠感興趣區(qū)rCBF和rCBV值是否有顯著差異。 5.組織學觀察：采用mNSS行為學評分法評價大鼠神經(jīng)功能；組織學切片觀察大鼠顱腦損傷的移植細胞生存狀況，及損傷區(qū)微循環(huán)的變化；電鏡觀察損傷區(qū)周圍的神經(jīng)細胞的存活狀態(tài)。 6.統(tǒng)計學分析：采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用X SD表示。正常對照組與實驗組計量資料比較采用兩隨機樣本t檢驗。以P0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。 結果 1.行為學評分：大鼠在建立創(chuàng)傷性顱腦損傷模型后，其神經(jīng)運動及感覺功能的恢復在7d是呈現(xiàn)出一定的差異性，根據(jù)mNSS行為學評分結果，A組和D組因為未受打擊，所以其神經(jīng)運動感覺功能正常為0分，B組（10.22±0.94），C組（9.02±1.06），差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 2.功能磁共振檢測：TBI大鼠的顱腦損傷區(qū)的PWI序列掃描結果經(jīng)整理得出rCBF和rCBV，rCBF和rCBV經(jīng)統(tǒng)計分析顯示大鼠的腦損傷區(qū)在7d時B組和C組的差異明顯，A組（99.24±0.87;101.36±0.98），B組（123.68±18.89;102.55±17.46）， C組（131.03±17.37;115.21±14.66）和D組（99.56±0.51;99.68±0.84），差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 3.組織學觀察：TBI大鼠的顱腦損傷區(qū)的微血管面密度在3d，7d和2w時，B組與C組比較差異明顯，B組3d、7d和2w是結果分別為（9.56±3.78），（20.62±3.25），（21.93±2.12），C組3d、7d和2w是結果分別為（12.38±2.45），（31.79±3.28），（33.59±3.52），有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。TBI大鼠的顱腦損傷區(qū)的血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor VEGF)的陽性染色顯示，B組在3d、7d和2w均低于C組。TBI大鼠的顱腦損傷區(qū)在2w和4w行免疫組化觀察膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein GFAP)的陽性表達率顯示，B組無陽性染色，C組有陽性染色。TBI大鼠的顱腦損傷區(qū)在2w和4w行免疫組化觀察神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase NSE)蛋白陽性表達率顯示，B組無陽性染色，C組有陽性染色。 結論 WJCs經(jīng)股靜脈移植可以顯著促進VEGF在腦損傷區(qū)的表達，促進腦損傷區(qū)周圍腦組織的毛細血管的生成。通過改善損傷局部的腦微循環(huán)，對創(chuàng)傷性顱腦損傷有明顯的治療作用。顯著改善了TBI大鼠的運動及感覺功能。
【關鍵詞】：創(chuàng)傷性顱腦損傷 人臍帶沃頓膠間充質干細胞 細胞移植 大鼠 微血管面密度 PWI
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R651.15
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-14
• 中英文縮略詞表14-15
• 前言15-18
• 材料與方法18-25
• 結果25-30
• 討論30-37
• 結論37-38
• 附圖38-42
• 參考文獻42-47
• 綜述47-61
• 參考文獻56-61
• 個人簡歷及攻讀碩士學位期間發(fā)表論文61-62
• 致謝62

【參考文獻】

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本文編號：760542