本文關(guān)鍵詞：人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療對大鼠腦損傷區(qū)微循環(huán)的影響

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【摘要】：背景 創(chuàng)傷性顱腦損傷（traumatic brain injury, TBI）是神經(jīng)外科最常見的疾病之一，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的飛快發(fā)展，跌落傷、交通傷、以及暴力傷等引起的TBI患者也同比增加。TBI的幸存者大部分都留下了不同程度的神經(jīng)心理疾病及肢體運(yùn)動(dòng)感覺障礙等，影響了他們的工作、生活以及社會(huì)活動(dòng)，他們一般都要進(jìn)行長時(shí)間的康復(fù)治療，并且需要陪護(hù)，這就浪費(fèi)了大量的社會(huì)資源。微循環(huán)的主要功能是進(jìn)行物質(zhì)交換，以及通過微動(dòng)脈阻力的變化控制組織器官血流量的大小，可是微循環(huán)的血管的舒縮活動(dòng)的控制主要與局部的代謝活動(dòng)有關(guān)，，因此局部代謝的變化會(huì)造成微循環(huán)的障礙，進(jìn)一步導(dǎo)致器官的生理功能受到影響。創(chuàng)傷性顱腦損傷出現(xiàn)的腦微循環(huán)的障礙是該病極為重要的病理生理學(xué)變化，是繼發(fā)性損害的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是疾病轉(zhuǎn)歸和影響神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)鍵因素。防治創(chuàng)傷性顱腦外傷后的腦微循環(huán)障礙是神經(jīng)外科重點(diǎn)關(guān)注的領(lǐng)域之一。 有研究證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療骨缺損時(shí)分泌血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可以促進(jìn)新生血管生成，但是對于創(chuàng)傷性顱腦損傷損傷區(qū)微循環(huán)的影響尚未可知，并且骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞由于取材不便、細(xì)胞數(shù)量受年齡限制等原因限制了應(yīng)用前景。人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stromal cells derived from Wharton’s jelly cells, WJCs）具有來源廣泛，且較其它間充質(zhì)干細(xì)胞易于分離培養(yǎng)、能夠大量獲取、且增殖分化能力較強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過促進(jìn)各種營養(yǎng)因子的分泌對受損的神經(jīng)系統(tǒng)起到保護(hù)及治療作用。目前尚沒有關(guān)于人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞移植后對腦損傷區(qū)域的腦微循環(huán)變化的研究，本研究將致力于人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞移植對腦損傷區(qū)微循環(huán)的影響。 近年來，功能磁共振成像技術(shù)取得了飛速的發(fā)展，除了能顯示的形態(tài)結(jié)構(gòu)學(xué)信息，還可以反映腦損傷后代謝、生理等方面的功能改變的信息。磁共振灌注成像（perfusion-weighted imaging, PWI)，常采用單次激發(fā)的平面回波自由感應(yīng)衰減(echo planar imaging of free induction decay, EPI-FID)序列，注入的造影劑到達(dá)腦組織感興趣區(qū)，使局部磁場改變而獲得信號。PWI能夠檢出局部組織的血流灌注情況，并且可以分析血流動(dòng)力學(xué)的改變以及功能的變化，并能根據(jù)需要重點(diǎn)反映組織的微血管分布以及血流灌注的情況。 目的 觀察人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞移植對SD大鼠腦損傷區(qū)域的微循環(huán)變化的影響，探討微循環(huán)變化對損傷區(qū)腦組織的保護(hù)及修復(fù)作用。 材料與方法 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級雄性SD大鼠72只(8周齡，體重250~300g)由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。跟據(jù)國家發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》，對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行適宜的安置。讓大鼠自由的攝食與飲水,室溫始終控制在(23±2)℃，相對濕度控制在40%-60%。 2.細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：離體的臍帶由健康足月剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦志愿捐獻(xiàn)，由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，無菌環(huán)境下取臍帶一段，剝離臍帶外膜，將沃頓膠組織剪碎后放置于含有bFGF（20μg/L）和FBS（10%）的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在含有CO2（5%）的37攝氏度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)及傳代。取傳代至P3代的人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行鏡下觀察及流式細(xì)胞儀檢測。 3.TBI模型的制作及分組:模型的建立采用Feeney的自由落體撞擊法，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)建立大鼠中度創(chuàng)傷性顱腦損傷模型。72只SD大鼠被隨機(jī)分為4組：依次為假手術(shù)組（A組），切開頭部皮膚，顱骨鉆孔后不損傷腦組織不移植細(xì)胞；移植對照組（B組），制作中度創(chuàng)傷性顱腦損傷模型成功后經(jīng)股靜脈靜脈注射0.3ml生理鹽水；WJCs移植組（C組），制作中度創(chuàng)傷性顱腦損傷模型成功后經(jīng)股靜脈靜脈注射WJCs混懸液0.3ml；正常組（D組），無任何損傷及干預(yù)措施。 4. PWI序列掃描：采用美國GE公司Discovery MR7503.0T高場強(qiáng)磁共振儀和大鼠專用線圈，各組大鼠均進(jìn)行橫軸位T1加權(quán)成像（T1-weighted imaging,T1WI）和T2加權(quán)成像（T2-weighted imaging, T2WI）、矢狀位T2WI、冠狀位T2WI及PWI的掃描。根據(jù)橫軸位T2WI掃描圖像為參考，觀察大鼠腦外傷后損傷灶周圍皮質(zhì)、丘腦、海馬及對側(cè)相應(yīng)部位在磁共振圖像上隨時(shí)間的變化情況，并記錄相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相應(yīng)部位腦組織的參數(shù)包括CBF和CBV。計(jì)算上述指標(biāo)的相對值(傷側(cè)/健側(cè))，分別得到rCBF和rCBV，盡可能降低個(gè)體差異所引起的誤差。比較實(shí)驗(yàn)組與對照組大鼠感興趣區(qū)rCBF和rCBV值是否有顯著差異。 5.組織學(xué)觀察：采用mNSS行為學(xué)評分法評價(jià)大鼠神經(jīng)功能；組織學(xué)切片觀察大鼠顱腦損傷的移植細(xì)胞生存狀況，及損傷區(qū)微循環(huán)的變化；電鏡觀察損傷區(qū)周圍的神經(jīng)細(xì)胞的存活狀態(tài)。 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用X SD表示。正常對照組與實(shí)驗(yàn)組計(jì)量資料比較采用兩隨機(jī)樣本t檢驗(yàn)。以P0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1.行為學(xué)評分：大鼠在建立創(chuàng)傷性顱腦損傷模型后，其神經(jīng)運(yùn)動(dòng)及感覺功能的恢復(fù)在7d是呈現(xiàn)出一定的差異性，根據(jù)mNSS行為學(xué)評分結(jié)果，A組和D組因?yàn)槲词艽驌�，所以其神�?jīng)運(yùn)動(dòng)感覺功能正常為0分，B組（10.22±0.94），C組（9.02±1.06），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2.功能磁共振檢測：TBI大鼠的顱腦損傷區(qū)的PWI序列掃描結(jié)果經(jīng)整理得出rCBF和rCBV，rCBF和rCBV經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析顯示大鼠的腦損傷區(qū)在7d時(shí)B組和C組的差異明顯，A組（99.24±0.87;101.36±0.98），B組（123.68±18.89;102.55±17.46）， C組（131.03±17.37;115.21±14.66）和D組（99.56±0.51;99.68±0.84），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3.組織學(xué)觀察：TBI大鼠的顱腦損傷區(qū)的微血管面密度在3d，7d和2w時(shí)，B組與C組比較差異明顯，B組3d、7d和2w是結(jié)果分別為（9.56±3.78），（20.62±3.25），（21.93±2.12），C組3d、7d和2w是結(jié)果分別為（12.38±2.45），（31.79±3.28），（33.59±3.52），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TBI大鼠的顱腦損傷區(qū)的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor VEGF)的陽性染色顯示，B組在3d、7d和2w均低于C組。TBI大鼠的顱腦損傷區(qū)在2w和4w行免疫組化觀察膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein GFAP)的陽性表達(dá)率顯示，B組無陽性染色，C組有陽性染色。TBI大鼠的顱腦損傷區(qū)在2w和4w行免疫組化觀察神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase NSE)蛋白陽性表達(dá)率顯示，B組無陽性染色，C組有陽性染色。 結(jié)論 WJCs經(jīng)股靜脈移植可以顯著促進(jìn)VEGF在腦損傷區(qū)的表達(dá)，促進(jìn)腦損傷區(qū)周圍腦組織的毛細(xì)血管的生成。通過改善損傷局部的腦微循環(huán)，對創(chuàng)傷性顱腦損傷有明顯的治療作用。顯著改善了TBI大鼠的運(yùn)動(dòng)及感覺功能。
【關(guān)鍵詞】：創(chuàng)傷性顱腦損傷 人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞 細(xì)胞移植 大鼠 微血管面密度 PWI
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R651.15
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-14
• 中英文縮略詞表14-15
• 前言15-18
• 材料與方法18-25
• 結(jié)果25-30
• 討論30-37
• 結(jié)論37-38
• 附圖38-42
• 參考文獻(xiàn)42-47
• 綜述47-61
• 參考文獻(xiàn)56-61
• 個(gè)人簡歷及攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文61-62
• 致謝62

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：760542