本文關(guān)鍵詞：蛋白激酶C抑制劑誘導(dǎo)表皮細(xì)胞去分化及microRNAs差異表達(dá)的研究

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【摘要】：目的探討蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)抑制劑GF109203X誘導(dǎo)表皮細(xì)胞去分化形成表皮樣干細(xì)胞的可能性及誘導(dǎo)前后微小RNA(micro-RNA,miRNA)的差異表達(dá)分析。方法(1)采用酶消化法分離培養(yǎng)人原代表皮細(xì)胞。(2)將獲得的細(xì)胞隨機(jī)分為2組,實(shí)驗(yàn)組:原代表皮細(xì)胞培養(yǎng)2d后加GF109203X,終濃度為10μM;對(duì)照組:同期分離的原代表皮細(xì)胞培養(yǎng)2d后加等體積二甲基亞砜(DMSO)。誘導(dǎo)2d后采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法對(duì)2組細(xì)胞行β1整合素、角蛋白19(cytokeratin19,CK19)、CK14、CK10單克隆抗體檢測(cè)鑒定。(3)TRIzol法提取2組細(xì)胞總RNA并用RNeasy Mini Kit純化,使用NanoDrop ND-1000測(cè)量純化后的RNA濃度,變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性,miRCURYTM Array Power Labeling kit標(biāo)記樣品并與miRCURYTM LNA Array(v.18.0)雜交芯片,Wash buffer kit清洗芯片后使用Axon GenePix 4000B掃描,GenePix pro 6.0讀取探針信號(hào)值,對(duì)采集數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化及差異表達(dá)分析,實(shí)時(shí)定量RT-PCR驗(yàn)證微陣列芯片檢測(cè)結(jié)果的可靠性。(4)對(duì)部分差異表達(dá)miRNAs靶基因行功能富集分析。結(jié)果(1)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞群誘導(dǎo)培養(yǎng)2d后形成明顯克隆,免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示β1整合素、CK19及CK14呈陽性表達(dá),CK10陰性表達(dá);對(duì)照組細(xì)胞群培養(yǎng)2d無明顯克隆形成,β1整合素、CK19及CK14呈陰性表達(dá),CK10呈陽性表達(dá)。(2)篩選出實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的miRNAs 45個(gè),表達(dá)下調(diào)的miRNAs34個(gè)。其中顯著上調(diào)的mi RNA有hsa-miR-1-3p,hsa-miR-374a-5p,hsa-miR-144-5p等;顯著下調(diào)的miRNA有hsa-miR-31-5p,hsa-let-7c-3p,hsa-miR-514a-3p等。(3)實(shí)時(shí)定量RT-PCR對(duì)表達(dá)上調(diào)最顯著的hsa-miR-1-3p及表達(dá)下調(diào)最顯著的hsa-miR-31-5p進(jìn)行驗(yàn)證,與芯片檢測(cè)結(jié)果具有較好的一致性。(4)miRNAs靶基因功能富集分析提示差異表達(dá)miRNAs參與細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞周期進(jìn)展、凋亡等生物學(xué)過程。結(jié)論蛋白激酶C抑制劑GF109203X可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)人表皮細(xì)胞去分化形成表皮樣干細(xì)胞,并引起表皮細(xì)胞miRNA的差異表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：去分化 表皮細(xì)胞 蛋白激酶C抑制劑GF109203X microRNA 表達(dá)譜
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R641
【目錄】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-8
• 中英文縮略詞表8-9
• 第1章 前言9-11
• 第2章 材料與方法11-20
• 2.1 材料11-12
• 2.1.1 標(biāo)本來源11
• 2.1.2 主要儀器11
• 2.1.3 主要試劑11-12
• 2.2 方法12-20
• 2.2.1 PKC抑制劑GF109203X的配制12
• 2.2.2 Ⅳ型膠原包被培養(yǎng)皿及蓋玻片的制備12-13
• 2.2.3 表皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與誘導(dǎo)13-14
• 2.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色分析14
• 2.2.5 提取兩組細(xì)胞中的總RNA14-15
• 2.2.6 RNasey Mini Kit對(duì)總RNA的分離純化15
• 2.2.7 純化后RNA的質(zhì)量檢查15-16
• 2.2.8 miRNA的熒光標(biāo)記、芯片雜交、清洗及掃描16-17
• 2.2.9 芯片數(shù)據(jù)處理17-18
• 2.2.10實(shí)時(shí)定量RT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果18-19
• 2.2.11顯著差異表達(dá)的miRNAs靶基因功能富集分析19-20
• 第3章 結(jié)果20-37
• 3.1 GF109203X對(duì)表皮細(xì)胞表型變化的影響20
• 3.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果分析20-22
• 3.3 總RNA提取結(jié)果22-23
• 3.4 芯片掃描結(jié)果23
• 3.5 散點(diǎn)圖及相關(guān)系數(shù)表23-24
• 3.6 篩查結(jié)果24-27
• 3.7 聚類圖27-28
• 3.8 Real Time RT-PCR驗(yàn)證分析結(jié)果28-31
• 3.9 差異表達(dá)miRNAs靶基因功能富集分析31-37
• 3.9.1 GO生物學(xué)功能分析結(jié)果31-33
• 3.9.2 GO分子功能分析結(jié)果33-34
• 3.9.3 GO在細(xì)胞成分分析結(jié)果34-35
• 3.9.4 差異表達(dá)miRNAs靶基因KEGG Pathway分析結(jié)果35-37
• 第4章 討論37-41
• 第5章 結(jié)論41-42
• 致謝42-43
• 參考文獻(xiàn)43-46
• 攻讀學(xué)位期間研究成果46-47
• 綜述47-52
• 參考文獻(xiàn)51-52

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

1 宋志芳;劉德伍;李津;;不同發(fā)育階段表皮細(xì)胞微小RNA的差異表達(dá)譜分析[J];中華創(chuàng)傷雜志;2014年05期

2 郝飛;張玲;吳巖;;表皮干細(xì)胞的生物學(xué)標(biāo)記物[J];中國(guó)組織工程研究;2013年36期

3 李勇鐵;劉德伍;劉德明;毛遠(yuǎn)桂;彭燕;寧璞;胡翔;鄒萍;鄒永紅;余群洪;;人誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞向表皮樣干細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華燒傷雜志;2012年04期

4 費(fèi)陽;張翠萍;付小兵;;不同來源的表皮干細(xì)胞促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合的研究[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2011年02期

5 孫曉艷;劉惠玲;付小兵;;bFGF誘導(dǎo)表皮細(xì)胞去分化形成短暫擴(kuò)充細(xì)胞[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2010年09期

6 鐘清玲;劉德伍;劉繁榮;彭燕;于玫;肖魯良;;羊膜負(fù)載表皮干細(xì)胞促進(jìn)糖尿病大鼠創(chuàng)面的愈合[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2010年32期

7 蔡颯;付小兵;盛志勇;;去分化:一種新的干細(xì)胞來源[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2007年08期

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本文編號(hào)：676445