本文關(guān)鍵詞：人補(bǔ)體受體1型衍生分子融合蛋白CR1-SCR2D的構(gòu)建及對(duì)小鼠膿毒癥炎癥損傷的保護(hù)作用

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【摘要】：膿毒癥(sepsis)是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatoryresponse syndrome, SIRS)，是住院危重患者的主要死亡原因之一。膿毒癥的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，涉及到各個(gè)系統(tǒng)的共同作用。其始動(dòng)環(huán)節(jié)之一，是補(bǔ)體系統(tǒng)識(shí)別病原微生物發(fā)生過(guò)度活化。病原菌的菌體成分、內(nèi)毒素、外毒素等使得補(bǔ)體系統(tǒng)過(guò)度激活，產(chǎn)生大量的炎癥效應(yīng)片段，造成后續(xù)級(jí)聯(lián)放大的炎癥反應(yīng)。目前抑制補(bǔ)體的過(guò)度活化已成為防治膿毒癥炎癥損傷的重要策略之一。 在經(jīng)典、旁路、凝集素三條通路中，補(bǔ)體激活的起始位點(diǎn)不同，但都形成C3轉(zhuǎn)化酶，在C3處匯合，進(jìn)而形成C5轉(zhuǎn)化酶，共同進(jìn)入終末途徑。如果能在C3處防止C3/C5轉(zhuǎn)化酶的形成，可減少炎癥效應(yīng)片段如C3a、C5a、C5b-9等的釋放，在一定程度上就能夠防止或減輕SIRS的發(fā)生與發(fā)展。 我室曾研制了人補(bǔ)體受體1型(complement receptor type1，CR1)的兩個(gè)活性片段短同源重復(fù)序列(short consensus repeats，SCR)1-3和SCR15-17，分別用畢赤酵母進(jìn)行表達(dá)，證明其具有體外抑制補(bǔ)體的生物活性作用和體內(nèi)抗炎保護(hù)作用。這兩個(gè)片段分別結(jié)合C4b和C3b，只能抑制一條或兩條補(bǔ)體激活通路，保護(hù)作用有限。因此，本研究構(gòu)建了能結(jié)合C4b、C3b的雙功能域CR1衍生分子(complement receptor type1-shortconsensus repeats of two domains, CR1-SCR2D)，檢測(cè)融合蛋白在體外抑制補(bǔ)體的生物活性，并進(jìn)行了小鼠膿毒癥損傷的保護(hù)性研究。本研究主要獲得了以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1．表達(dá)質(zhì)粒pPICZαB-SCR2D的構(gòu)建。將畢赤酵母質(zhì)粒pPIC9k原有的多克隆位點(diǎn)替換為新的多克隆位點(diǎn)pPIC9k(+)；用我室前期構(gòu)建的pPIC9k-SCR1-3和pPIC9k-SCR15-17作模板，PCR擴(kuò)增基因SCR1-3和SCR15-17，依次克隆連接到pPIC9k(+)上，在二者中間加入linker序列，構(gòu)建含有目的基因的重組質(zhì)粒pPIC9k(+)-SCR2D；最后將目的基因SCR2D克隆到載體pPICZαB上，得到表達(dá)載體pPICZαB-SCR2D。雙酶切和測(cè)序鑒定表明，表達(dá)質(zhì)粒pPICZαB-SCR2D構(gòu)建成功。 2．表達(dá)質(zhì)粒pPICZαB-SCR2D電轉(zhuǎn)化畢赤酵母后進(jìn)行表達(dá)及鑒定。表達(dá)質(zhì)粒pPICZαB-SCR2D經(jīng)過(guò)Sac I單酶切后電轉(zhuǎn)畢赤酵母X-33感受態(tài)，從博來(lái)霉素(Zeocin)的YPD平板上挑取單克隆，行PCR鑒定陽(yáng)性重組子。確立目的蛋白在重組酵母X-33/CR1-SCR2D中有分泌表達(dá)。采用小鼠抗人CR1抗體經(jīng)Western blot鑒定，在分子量約90kDa處出現(xiàn)陽(yáng)性條帶。 3．目的蛋白CR1-SCR2D經(jīng)Ni-NTA柱純化及糖基化鑒定。表達(dá)上清過(guò)Ni-NTA柱后，低濃度咪唑洗脫雜蛋白，高濃度咪唑洗脫目的蛋白。SDS-PAGE電泳顯示，，在分子量約90kDa處有彌散條帶，目的蛋白純度較高。目的蛋白經(jīng)29kDa的Endo H糖苷酶處理后，分子量達(dá)到理論大小的45kDa，帶型也變規(guī)則，證明CR1-SCR2D存在糖基化。 4．目的蛋白CR1-SCR2D的體外抑制補(bǔ)體生物活性鑒定。用CH50和AH50對(duì)目的蛋白CR1-SCR2D進(jìn)行經(jīng)典途徑和旁路途徑抑制補(bǔ)體活性檢測(cè)，結(jié)果顯示CR1-SCR2D均可抑制兩條通路的激活，并且抑制補(bǔ)體活性分別高于SCR1-3和SCR15-17。去糖基化后的CR1-SCR2D對(duì)CH50和AH50溶血活性沒有影響。另外證明CR1-SCR2D對(duì)旁路和MBL途徑激活片段C4b、C3b在酵母多糖上沉積有抑制作用。 5．目的蛋白CR1-SCR2D對(duì)膿毒癥小鼠炎癥損傷的保護(hù)性效應(yīng)。用盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)(CLP)成功構(gòu)建小鼠的膿毒癥模型。進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明CR1-SCR2D在一定程度上能保護(hù)小鼠96h的生存率。CR1-SCR2D可以降低膿毒癥小鼠24h后血清C5a、IL-6和TNF-α的水平，降低膿毒癥小鼠肺臟的MPO水平，降低膿毒癥小鼠血液的細(xì)菌水平。免疫組化結(jié)果表明，CR1-SCR2D使膿毒癥小鼠C4b、C3b在肺臟上的沉積減少。小鼠肺臟病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，CR1-SCR2D明顯減輕了肺泡間隔和肺泡腔內(nèi)出血、水腫、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、局部實(shí)變的病理?yè)p傷。 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZαB-SCR2D，實(shí)現(xiàn)了目的蛋白CR1-SCR2D在畢赤酵母中的分泌表達(dá)，經(jīng)過(guò)純化獲得了目的蛋白。體外生物活性結(jié)果證明，目的蛋白CR1-SCR2D可以抑制補(bǔ)體三條通路的激活。在小鼠體內(nèi)，補(bǔ)體在膿毒癥炎癥損傷中起了重要作用，CR1-SCR2D通過(guò)抑制補(bǔ)體的過(guò)度激活達(dá)到了對(duì)膿毒癥小鼠炎癥損傷的保護(hù)效應(yīng)。研究結(jié)果為膿毒癥治療的深入研究提供了新的思路和途徑。
【關(guān)鍵詞】：補(bǔ)體受體1型 融合蛋白 畢赤酵母 補(bǔ)體抑制活性 膿毒癥 盲腸結(jié)扎穿刺術(shù) 保護(hù)作用
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R459.7
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-8
• 氨基酸縮寫表8-9
• Abstract9-12
• 摘要12-14
• 第一章 前言14-23
• 1.1 選題緣由14-15
• 1.2 研究背景15-21
• 1.3 研究意義21
• 1.4 研究?jī)?nèi)容21
• 1.5 研究方法21-23
• 第二章 人補(bǔ)體受體 1 型衍生分子融合基因 CR1-SCR2D 的構(gòu)建、表達(dá)及生物學(xué)活性鑒定23-68
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料23-34
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法34-52
• 2.3 結(jié)果52-62
• 2.4 討論62-68
• 第三章 補(bǔ)體在膿毒癥小鼠炎癥損傷中的作用及 CR1-SCR2D 的保護(hù)作用68-89
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料68-71
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法71-78
• 3.3 結(jié)果78-85
• 3.4 討論85-89
• 全文總結(jié)89-90
• 參考文獻(xiàn)90-97
• 文獻(xiàn)綜述97-114
• 參考文獻(xiàn)107-114
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果114-115
• 致謝115

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中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 張立天,陸家齊,姚詠明;膿毒癥的預(yù)警指標(biāo)及臨床意義[J];中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué);2001年05期

2 文愛清,蔣建新;膿毒癥與基因多態(tài)性相關(guān)性研究進(jìn)展[J];創(chuàng)傷外科雜志;2005年06期

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本文編號(hào)：671466