本文關鍵詞：人補體受體1型衍生分子融合蛋白CR1-SCR2D的構(gòu)建及對小鼠膿毒癥炎癥損傷的保護作用

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【摘要】：膿毒癥(sepsis)是由感染引起的全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatoryresponse syndrome, SIRS)，是住院危重患者的主要死亡原因之一。膿毒癥的發(fā)病機制比較復雜，涉及到各個系統(tǒng)的共同作用。其始動環(huán)節(jié)之一，是補體系統(tǒng)識別病原微生物發(fā)生過度活化。病原菌的菌體成分、內(nèi)毒素、外毒素等使得補體系統(tǒng)過度激活，產(chǎn)生大量的炎癥效應片段，造成后續(xù)級聯(lián)放大的炎癥反應。目前抑制補體的過度活化已成為防治膿毒癥炎癥損傷的重要策略之一。 在經(jīng)典、旁路、凝集素三條通路中，補體激活的起始位點不同，但都形成C3轉(zhuǎn)化酶，在C3處匯合，進而形成C5轉(zhuǎn)化酶，共同進入終末途徑。如果能在C3處防止C3/C5轉(zhuǎn)化酶的形成，可減少炎癥效應片段如C3a、C5a、C5b-9等的釋放，在一定程度上就能夠防止或減輕SIRS的發(fā)生與發(fā)展。 我室曾研制了人補體受體1型(complement receptor type1，CR1)的兩個活性片段短同源重復序列(short consensus repeats，SCR)1-3和SCR15-17，分別用畢赤酵母進行表達，證明其具有體外抑制補體的生物活性作用和體內(nèi)抗炎保護作用。這兩個片段分別結(jié)合C4b和C3b，只能抑制一條或兩條補體激活通路，保護作用有限。因此，本研究構(gòu)建了能結(jié)合C4b、C3b的雙功能域CR1衍生分子(complement receptor type1-shortconsensus repeats of two domains, CR1-SCR2D)，檢測融合蛋白在體外抑制補體的生物活性，并進行了小鼠膿毒癥損傷的保護性研究。本研究主要獲得了以下實驗結(jié)果： 1．表達質(zhì)粒pPICZαB-SCR2D的構(gòu)建。將畢赤酵母質(zhì)粒pPIC9k原有的多克隆位點替換為新的多克隆位點pPIC9k(+)；用我室前期構(gòu)建的pPIC9k-SCR1-3和pPIC9k-SCR15-17作模板，PCR擴增基因SCR1-3和SCR15-17，依次克隆連接到pPIC9k(+)上，在二者中間加入linker序列，構(gòu)建含有目的基因的重組質(zhì)粒pPIC9k(+)-SCR2D；最后將目的基因SCR2D克隆到載體pPICZαB上，得到表達載體pPICZαB-SCR2D。雙酶切和測序鑒定表明，表達質(zhì)粒pPICZαB-SCR2D構(gòu)建成功。 2．表達質(zhì)粒pPICZαB-SCR2D電轉(zhuǎn)化畢赤酵母后進行表達及鑒定。表達質(zhì)粒pPICZαB-SCR2D經(jīng)過Sac I單酶切后電轉(zhuǎn)畢赤酵母X-33感受態(tài)，從博來霉素(Zeocin)的YPD平板上挑取單克隆，行PCR鑒定陽性重組子。確立目的蛋白在重組酵母X-33/CR1-SCR2D中有分泌表達。采用小鼠抗人CR1抗體經(jīng)Western blot鑒定，在分子量約90kDa處出現(xiàn)陽性條帶。 3．目的蛋白CR1-SCR2D經(jīng)Ni-NTA柱純化及糖基化鑒定。表達上清過Ni-NTA柱后，低濃度咪唑洗脫雜蛋白，高濃度咪唑洗脫目的蛋白。SDS-PAGE電泳顯示，，在分子量約90kDa處有彌散條帶，目的蛋白純度較高。目的蛋白經(jīng)29kDa的Endo H糖苷酶處理后，分子量達到理論大小的45kDa，帶型也變規(guī)則，證明CR1-SCR2D存在糖基化。 4．目的蛋白CR1-SCR2D的體外抑制補體生物活性鑒定。用CH50和AH50對目的蛋白CR1-SCR2D進行經(jīng)典途徑和旁路途徑抑制補體活性檢測，結(jié)果顯示CR1-SCR2D均可抑制兩條通路的激活，并且抑制補體活性分別高于SCR1-3和SCR15-17。去糖基化后的CR1-SCR2D對CH50和AH50溶血活性沒有影響。另外證明CR1-SCR2D對旁路和MBL途徑激活片段C4b、C3b在酵母多糖上沉積有抑制作用。 5．目的蛋白CR1-SCR2D對膿毒癥小鼠炎癥損傷的保護性效應。用盲腸結(jié)扎穿刺術(CLP)成功構(gòu)建小鼠的膿毒癥模型。進行分組實驗，結(jié)果表明CR1-SCR2D在一定程度上能保護小鼠96h的生存率。CR1-SCR2D可以降低膿毒癥小鼠24h后血清C5a、IL-6和TNF-α的水平，降低膿毒癥小鼠肺臟的MPO水平，降低膿毒癥小鼠血液的細菌水平。免疫組化結(jié)果表明，CR1-SCR2D使膿毒癥小鼠C4b、C3b在肺臟上的沉積減少。小鼠肺臟病理學檢查結(jié)果顯示，CR1-SCR2D明顯減輕了肺泡間隔和肺泡腔內(nèi)出血、水腫、炎細胞浸潤、局部實變的病理損傷。 綜上所述，本實驗成功構(gòu)建畢赤酵母表達質(zhì)粒pPICZαB-SCR2D，實現(xiàn)了目的蛋白CR1-SCR2D在畢赤酵母中的分泌表達，經(jīng)過純化獲得了目的蛋白。體外生物活性結(jié)果證明，目的蛋白CR1-SCR2D可以抑制補體三條通路的激活。在小鼠體內(nèi)，補體在膿毒癥炎癥損傷中起了重要作用，CR1-SCR2D通過抑制補體的過度激活達到了對膿毒癥小鼠炎癥損傷的保護效應。研究結(jié)果為膿毒癥治療的深入研究提供了新的思路和途徑。
【關鍵詞】：補體受體1型 融合蛋白 畢赤酵母 補體抑制活性 膿毒癥 盲腸結(jié)扎穿刺術 保護作用
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R459.7
【目錄】：

• 縮略語表5-8
• 氨基酸縮寫表8-9
• Abstract9-12
• 摘要12-14
• 第一章 前言14-23
• 1.1 選題緣由14-15
• 1.2 研究背景15-21
• 1.3 研究意義21
• 1.4 研究內(nèi)容21
• 1.5 研究方法21-23
• 第二章 人補體受體 1 型衍生分子融合基因 CR1-SCR2D 的構(gòu)建、表達及生物學活性鑒定23-68
• 2.1 實驗材料23-34
• 2.2 實驗方法34-52
• 2.3 結(jié)果52-62
• 2.4 討論62-68
• 第三章 補體在膿毒癥小鼠炎癥損傷中的作用及 CR1-SCR2D 的保護作用68-89
• 3.1 實驗材料68-71
• 3.2 實驗方法71-78
• 3.3 結(jié)果78-85
• 3.4 討論85-89
• 全文總結(jié)89-90
• 參考文獻90-97
• 文獻綜述97-114
• 參考文獻107-114
• 攻讀學位期間的研究成果114-115
• 致謝115

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1 張立天,陸家齊,姚詠明;膿毒癥的預警指標及臨床意義[J];中國危重病急救醫(yī)學;2001年05期

2 文愛清,蔣建新;膿毒癥與基因多態(tài)性相關性研究進展[J];創(chuàng)傷外科雜志;2005年06期

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本文編號：671466