本文關(guān)鍵詞：血管內(nèi)皮細(xì)胞抗發(fā)形霞水母觸手提取物縮血管反應(yīng)的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：目的： 探討血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cells，VECs）在抗發(fā)形霞水母（Cyanea capillata）觸手提取物（tentacle extract，TE）縮血管反應(yīng)中的保護(hù)作用，為防治C.capillata蜇傷提供新思路和新靶點(diǎn)。 方法： 1、驗(yàn)證TE對(duì)人奇靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）的毒性作用： 1.1MTT法測(cè)細(xì)胞存活率：收集我國沿海C. capillata并經(jīng)鑒定后提取C.capillata TE樣品。①以濃度梯度為控制因素，加入不同濃度（0μg/ml、0.625μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml、320μg/ml）TE孵育細(xì)胞密度為4×105個(gè)/ml的HUVEC細(xì)胞6h，MTT法檢測(cè)經(jīng)HUVEC細(xì)胞的存活率。②另一方面以不同濃度（1μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml）TE不同時(shí)間（6h，12h，24h，48h）孵育細(xì)胞密度為4×105個(gè)/ml的HUVEC細(xì)胞，MTT法檢測(cè)HUVEC細(xì)胞的存活率。 1.2流式細(xì)胞術(shù)測(cè)TE作用后HUVEC細(xì)胞凋亡壞死：加入不同濃度（0μg/ml、1μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml）TE處理HUVEC細(xì)胞6h后，采用流式細(xì)胞分析檢測(cè)HUVEC細(xì)胞的凋亡。 2、血管舒縮因子前列環(huán)素（Prostacyclin，PGI2）、血栓素（Thromboxane，TXA2）、血管緊張素（Angiotensin Ⅱ，AngⅡ）含量檢測(cè)： 2.1加入不同濃度TE（0μg/ml，1μg/ml，，2.5μg/ml，5μg/ml）作用HUVEC細(xì)胞6h，采用ELISA檢測(cè)不同濃度TE作用HUVEC細(xì)胞后分泌PGI2、TXA2、AngⅡ的含量。 2.2濃度為5μg/ml TE加入HUVEC細(xì)胞后，分別作用0min、5min、30min、2h、6h、12h后，采用ELISA檢測(cè)TE不同孵育時(shí)間HUVEC細(xì)胞分泌PGI2、TXA2、AngⅡ的含量。 3、觀察SD大鼠股動(dòng)脈血壓（Blood pressure，BP）變化： SD大鼠（280～320g）麻醉后，行股主動(dòng)脈插管及頸靜脈插管法，分別予①對(duì)照組（0.9%生理鹽水組）；②1.4mg/ml TE組；③10μmol/L環(huán)氧合酶抑制劑（吲哚美辛）+1.4mg/ml TE組；④10μmol/L血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（卡托普利）+1.4mg/ml TE組藥物干預(yù)。觀察1h內(nèi)股動(dòng)脈BP的變化情況，以明確藥物干預(yù)效果及VECs在TE縮血管毒性過程中的保護(hù)作用，并為臨床治療水母蜇傷篩選出有效的治療藥物。 4、SD大鼠心臟、腎臟功能的影響： 在整體動(dòng)物檢測(cè)BP變化情況實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，迅速從股動(dòng)脈插管處抽取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)脈血，檢測(cè)心肌酶、腎功能（LDH、CK、sCr及BUN）。結(jié)果： 1、TE對(duì)HUVEC細(xì)胞存活率的影響： ①當(dāng)TE濃度小于2.5μg/ml時(shí)，HUVEC細(xì)胞存活率為100%，細(xì)胞活性與正常對(duì)照組（TE濃度0μg/ml）相比無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；當(dāng)TE濃度大于5μg/ml時(shí)，HUVEC細(xì)胞開始出現(xiàn)死亡，TE濃度為5μg/ml時(shí)細(xì)胞存活率為97.55%，TE濃度為10μg/ml時(shí)細(xì)胞存活率為50%，當(dāng)TE濃度為320μg/ml時(shí)HUVEC細(xì)胞已幾乎全部死亡，細(xì)胞存活率僅為4.83%，以上結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此在濃度為5～320μg/ml范圍內(nèi)時(shí)TE對(duì)HUVEC細(xì)胞的毒性作用具有濃度依賴性，隨著TE濃度的增加其對(duì)HUVEC細(xì)胞毒性增強(qiáng)。 ②同一濃度TE隨著預(yù)孵時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)HUVEC細(xì)胞產(chǎn)生的毒性作用不斷增強(qiáng)，TE的毒性作用具有時(shí)間依賴性(P0.05)；當(dāng)TE濃度為1μg/ml時(shí)，分別預(yù)孵HUVEC細(xì)胞6h和12h可見細(xì)胞存活率大于100%，由此可知TE在低濃度（≤1μg/ml）短時(shí)間（≤12h）內(nèi)對(duì)HUVEC細(xì)胞具有促生長(zhǎng)的作用，當(dāng)TE濃度為2.5μg/ml時(shí)，預(yù)孵6h時(shí)細(xì)胞存活率100%，TE濃度為5μg/ml時(shí)，預(yù)孵6h時(shí)細(xì)胞開始出現(xiàn)死亡，TE濃度10μg/ml時(shí)HUVEC細(xì)胞大量死亡，細(xì)胞存活率小于50%(P0.05)。 由以上實(shí)驗(yàn)可知，濃度為5μg/ml的C.capillata TE預(yù)孵HUVEC細(xì)胞6h可引起細(xì)胞死亡,因此選擇濃度為5μg/ml的TE做后續(xù)的實(shí)驗(yàn)；10μg/mlTE預(yù)孵6h可引起細(xì)胞明顯死亡。 2、TE致HUVEC細(xì)胞凋亡與壞死： TE濃度在1～10μg/ml濃度時(shí)，導(dǎo)致的細(xì)胞壞死不明顯（P＞0.05），在1μg/ml和2.5μg/ml濃度時(shí)TE導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡尚不明顯（P＞0.05），當(dāng)TE濃度5μg/ml時(shí)可有部分細(xì)胞凋亡，當(dāng)TE濃度10μg/ml時(shí)可有大量細(xì)胞凋亡（P＜0.05）。 3、血管舒縮因子PGI2、TXA2、AngⅡ含量檢測(cè)： ①PGI2隨TE作用濃度增加分泌量逐漸增大，TXA2隨TE作用濃度增加分泌量無明顯變化，PGI2/TXA2隨TE作用濃度增大比值增大，AngⅡ隨TE濃度增大分泌量增大，以上結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。故HUVEC細(xì)胞分泌的PGI2、AngⅡ及PGI2/TXA2比值在TE作用下可發(fā)生變化，且具有劑量依賴性，隨TE濃度增大而增大。 ②TE（5μg/ml）預(yù)孵HUVEC細(xì)胞一定時(shí)間內(nèi)（0min～12h）可引起HUVEC細(xì)胞舒縮因子PGI2、TXA2、AngⅡ分泌量改變，PGI2隨著TE刺激時(shí)間的延長(zhǎng)分泌量逐漸增加，5min時(shí)分泌量達(dá)高峰，6h分泌量開始下降，但分泌量仍高于正常水平，12h與6h分泌量無明顯差別；TXA2隨著TE刺激時(shí)間的增加分泌量逐漸增高，在6h到達(dá)高峰，12h與6h分泌量無明顯差別； AngⅡ在5min分泌量仍高于正常水平，在2h達(dá)最高值，6h分泌量又下降，但分泌量仍高于正常水平，分泌量6h與12h分泌量無明顯差別，以上結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4、SD大鼠股動(dòng)脈BP變化 在觀察時(shí)間（60min）內(nèi)，與對(duì)照組（0.9%生理鹽水組）相比，1.4mg/ml TE組SD大鼠股動(dòng)脈BP在前10min內(nèi)明顯下降，10min時(shí)達(dá)最低值，后逐漸升高，60min時(shí)恢復(fù)至起始BP水平，整個(gè)觀察時(shí)間內(nèi)BP平均值均低于對(duì)照組；10μmol/L環(huán)氧合酶抑制劑（吲哚美辛）+1.4mg/ml TE組在觀察時(shí)間內(nèi)BP值較對(duì)照組無明顯變化；10μmol/L血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（卡托普利）+1.4mg/mlTE組在前10min內(nèi)BP先下降后升高，在20～30min內(nèi)恢復(fù)至對(duì)照組水平，后BP繼續(xù)升高，且高于對(duì)照組，以上結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5、SD大鼠心、腎功能檢測(cè)： 在整體動(dòng)物股動(dòng)脈BP監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，從股動(dòng)脈抽取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)脈血，低溫超速離心后取上清，行血生化檢測(cè)結(jié)果顯示與對(duì)照組（0.9%生理鹽水組）相比，1.4mg/ml TE組SD大鼠心肌酶譜（LDH、CK）明顯升高，腎功能（sCr、BUN）嚴(yán)重?fù)p害；10μmol/L環(huán)氧合酶抑制劑（吲哚美辛）+1.4mg/ml TE組、10μmol/L血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（卡托普利）+1.4mg/ml TE組心肌酶（LDH、CK）升高較1.4mg/ml TE組低，腎功能（sCr、BUN）損害較較1.4mg/ml TE組輕，以上結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1.證明了TE對(duì)HUVEC細(xì)胞有直接的毒性作用，一定濃度TE及預(yù)孵時(shí)間可導(dǎo)致HUVEC細(xì)胞壞死與凋亡，降低細(xì)胞存活率。 2.TE作用HUVEC細(xì)胞，HUVEC細(xì)胞分泌PGI2、TXA2、AngⅡ含量可發(fā)生變化，HUVEC細(xì)胞通過對(duì)舒縮因子分泌量的調(diào)節(jié)，以此來拮抗TE引起的血管收縮反應(yīng)。 3. TE可降低動(dòng)物平均動(dòng)脈BP及造成嚴(yán)重心腎功能損害，環(huán)氧合酶抑制劑（吲哚美辛）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑可調(diào)節(jié)VECs分泌舒縮因子PGI2、TXA2、AngⅡ的含量而拮抗TE特異的縮血管反應(yīng)及降BP效應(yīng)，并且減輕了心腎功能損傷。
【關(guān)鍵詞】：血管內(nèi)皮細(xì)胞 發(fā)形霞水母毒素 血管收縮 血管舒縮因子 吲哚美辛 卡托普利
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R646
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-14
• 英文縮寫及全文和中文對(duì)照表14-15
• 第1章 引言15-18
• 技術(shù)路線18-19
• 第2章 材料與儀器19-23
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞19
• 2.3 實(shí)驗(yàn)試劑19-20
• 2.3.1 主要購置試劑19-20
• 2.3.2 主要配置試劑20
• 2.4 實(shí)驗(yàn)儀器20-21
• 2.5 動(dòng)靜脈導(dǎo)管制備21-23
• 第3章 方法23-28
• 3.1 實(shí)驗(yàn)思路23
• 3.2 C. capillata 采集與 TE 獲取23
• 3.3 HUVEC 細(xì)胞培養(yǎng)23-24
• 3.4 檢測(cè) TE 對(duì) HUVEC 的毒性作用24-25
• 3.4.1 MTT 檢測(cè) HUVEC 細(xì)胞存活率24
• 3.4.2 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè) HUVEC 細(xì)胞凋亡24-25
• 3.5 ELISA 法檢測(cè)血管舒縮因子 PGI2、TXA2、AngⅡ分泌量25-26
• 3.6 SD 大鼠動(dòng)脈 BP 監(jiān)測(cè)觀察 VEC 的生物學(xué)效應(yīng)及拮抗藥物的干預(yù)效果26-27
• 3.7 心肌酶（LDH、CK）、腎功能（sCr、BUN）檢測(cè)27
• 3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理27-28
• 第4章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-39
• 4.1 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率28-30
• 4.1.1 不同濃度 TE 作用對(duì) HUVEC 細(xì)胞存活率的影響28-29
• 4.1.2 不同濃度、不同時(shí)間 TE 作用對(duì) HUVEC 細(xì)胞存活率的影響29-30
• 4.2 Annexin V-PI 雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡30-32
• 4.3 ELISA 法檢測(cè)血管舒縮因子 PGI2、TXA2、AngⅡ分泌量32-35
• 4.3.1 檢測(cè)不同濃度 TE 作用 HUVEC 細(xì)胞后 PGI2、TXA2、AngⅡ分泌量32-34
• 4.3.2 檢測(cè)同一濃度 TE 不同作用時(shí)間 HUVEC 細(xì)胞 PGI2、TXA2、AngⅡ分泌量34-35
• 4.4 SD 大鼠動(dòng)脈 BP 監(jiān)測(cè)觀察 VEC 的體內(nèi)效應(yīng)及拮抗藥物的干預(yù)效果35-37
• 4.5 SD 大鼠心、腎功能生化指標(biāo)檢測(cè)37-39
• 第5章 討論39-44
• 5.1 血管內(nèi)皮細(xì)胞在發(fā)形霞水母毒素毒性反應(yīng)中的屏障保護(hù)作用39-40
• 5.2 血管內(nèi)皮細(xì)胞在水母毒素反應(yīng)中對(duì)血管舒縮因子分泌量的調(diào)節(jié)40-42
• 5.3 VECs 抗 TE 縮血管毒性反應(yīng)的效應(yīng)及初步藥物篩選42-44
• 第6章 結(jié)論與展望44-45
• 6.1 結(jié)論44
• 6.2 展望44-45
• 致謝45-46
• 參考文獻(xiàn)46-49
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果49-50
• 綜述50-56
• 摘要50-55
• 參考文獻(xiàn)55-56

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 周穎;陳虹;;血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂與心血管疾病關(guān)系的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2006年08期

本文編號(hào)：648626