本文關(guān)鍵詞：微小RNA在糖尿病創(chuàng)面中的差異表達(dá)及GM-CSF的干預(yù)作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:觀察糖尿病大鼠與正常大鼠皮膚創(chuàng)面組織微小RNA(miRNA)差異表達(dá)以及重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子(rhGM-CSF)凝膠對糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合及微小RNA表達(dá)的影響,為進(jìn)一步探討糖尿病創(chuàng)面難愈合機(jī)制及其靶向治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:(1)雄性清潔級SD大鼠,體重200~250g,一次性腹腔注射鏈脲佐菌素65mg/kg建立糖尿病大鼠模型。4周后取糖尿病成模大鼠及正常大鼠各6只于背部制備全層皮膚切除創(chuàng)面,造模3 d后手術(shù)切取上述創(chuàng)面組織。用Trizol抽提總RNA并質(zhì)檢,純化后進(jìn)行熒光標(biāo)記、芯片雜交,然后掃描得到雜交圖片。利用軟件提取數(shù)據(jù)并行差異分析。實(shí)時(shí)定量RT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果。(2)另取大鼠18只同前述方法建立糖尿病模型,4周后取其中穩(wěn)定成模的16只糖尿病大鼠于背部兩側(cè)制作4個(gè)面積為(4.32±0.14)cm2全層皮膚缺損創(chuàng)面。采用配對設(shè)計(jì)、盲法、隨機(jī)數(shù)字表法分為2組,揭盲顯示A組為rhGM-CSF凝膠組、B組為外用型凝膠基質(zhì)組。2組均每日涂布藥膏1次,厚度為3 mm(rhGM-CSF實(shí)際作用量約為1μg/cm2),至傷后14 d。大體觀察各組創(chuàng)面愈合情況,并于傷后3、7 d計(jì)算創(chuàng)面愈合率。傷后3、7、14 d,分別取1、2、4只糖尿病大鼠采集標(biāo)本,行HE染色觀察組織病理學(xué)改變,免疫組織化學(xué)染色檢測創(chuàng)面CD31和PCNA表達(dá)。傷后7 d另取3只糖尿病大鼠采集組織樣本,同前法行芯片檢測并驗(yàn)證其結(jié)果。對差異表達(dá)明顯的微小RNA行京都基因和基因組百科全書(KEGG)信號(hào)通路功能富集分析。對數(shù)據(jù)行配對樣本t檢驗(yàn)或兩樣本t檢驗(yàn)。結(jié)果:(1)篩選出在糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面組織中上調(diào)的微小RNA有18個(gè),下調(diào)65個(gè)。其中顯著上調(diào)的微小RNA有大鼠-微小RNA-496-5p、大鼠-微小RNA-105、大鼠-微小RNA-122-5p等;顯著下調(diào)的微小RNA有大鼠-微小RNA-196a-5p、大鼠-微小RNA-134-5p、大鼠-微小RNA-31-3p等。PCR的驗(yàn)證結(jié)果與與芯片檢測結(jié)果接近。功能富集分析顯示差異表達(dá)明顯的miR-31、miR-222、miR-449a等微小RNA分別參與有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK)、Wnt、Notch等與創(chuàng)面修復(fù)相關(guān)的信號(hào)通路。(2)①傷后3 d兩組創(chuàng)面肉芽組織增生明顯,傷后7 d兩組創(chuàng)腔均基本被肉芽組織填平(其中A組創(chuàng)面縮小更明顯且肉芽組織量多),傷后14 d A組全部創(chuàng)面基本愈合而B組部分創(chuàng)面仍存在少許創(chuàng)腔及結(jié)痂。傷后3、7 d,A組創(chuàng)面愈合率分別為(41±5)%和(75±4)%均明顯高于B組的(31±9)%和(71±4)%(P值均小于0.001)。②傷后3 d兩組創(chuàng)面表皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞(Fb)等組織修復(fù)細(xì)胞均排列稀疏,有大量炎性細(xì)胞浸潤(其中B組創(chuàng)面組織修復(fù)細(xì)胞及炎性細(xì)胞均較少)。傷后7 d兩組創(chuàng)面內(nèi)皮細(xì)胞、Fb排列漸致密,浸潤的炎性細(xì)胞較前減少(其中A組創(chuàng)面組織修復(fù)細(xì)胞數(shù)量較B組多)。傷后14 d兩組創(chuàng)面組織中內(nèi)皮細(xì)胞、Fb細(xì)胞排列明顯致密(其中A組表皮完全覆蓋創(chuàng)面,B組部分創(chuàng)面仍有炎性浸潤)。③傷后3、7 d兩組創(chuàng)面肉芽組織中CD31和PCNA陽性表達(dá)均明顯,傷后14 d表達(dá)均減弱。傷后3、7、14 d,A組創(chuàng)面CD31和PCNA陽性表達(dá)均較B組明顯(P0.05)。④總RNA抽提及質(zhì)檢判定樣本總量、純度、完整性均符合實(shí)驗(yàn)要求。微小RNA芯片檢測篩選,與B組比較A組創(chuàng)面組織中的微小RNA上調(diào)18個(gè)、下調(diào)13個(gè)。⑤實(shí)時(shí)定量RT-PCR的驗(yàn)證結(jié)果顯示A組創(chuàng)面組織中大鼠-微小RNA-29b、大鼠-微小RNA-347的表達(dá)量較B組分別為上調(diào)2.58倍、下調(diào)1.89倍;與芯片檢測結(jié)果接近(分別為上調(diào)2.67倍、下調(diào)2.18倍)。⑥KEGG信號(hào)通路功能富集分析顯示差異表達(dá)明顯的微小RNA參與MAPK信號(hào)途徑、Wnt信號(hào)途徑、轉(zhuǎn)化生長因子β信號(hào)途徑、表皮生長因子受體信號(hào)途徑等與創(chuàng)面修復(fù)相關(guān)的信號(hào)通路。結(jié)論:(1)糖尿病大鼠與正常大鼠皮膚創(chuàng)面組織中的微小RNA表達(dá)差異明顯,功能富集分析顯示其與創(chuàng)面修復(fù)相關(guān)的信號(hào)通路密切相關(guān),可能與糖尿病創(chuàng)面難愈合機(jī)制存在密切的聯(lián)系。(2)rhGM-CSF凝膠可促進(jìn)糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合,引起創(chuàng)面組織中微小RNA差異性表達(dá),這可能是其促進(jìn)創(chuàng)面愈合在基因轉(zhuǎn)錄后水平上的靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子 重組 糖尿病 實(shí)驗(yàn)性 傷口愈合 基因表達(dá)譜 微小RNA
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R587.1;R641
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 第一部分 糖尿病創(chuàng)面與正常創(chuàng)面微小RNA差異表達(dá)譜分析11-26
• 1 前言11
• 2 材料和方法11-17
• 2.1 材料11-12
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物11-12
• 2.1.2 主要試劑12
• 2.1.3 主要儀器12
• 2.2 方法12-17
• 2.2.1 糖尿病大鼠模型的建立12-13
• 2.2.2 糖尿病大鼠與正常大鼠創(chuàng)面模型的建立13
• 2.2.3 樣本采集13
• 2.2.4 提取組織中的總RNA13-14
• 2.2.5 總RNA質(zhì)量檢查14
• 2.2.6 總RNA的分離純化14
• 2.2.7 微小RNA的熒光標(biāo)記和芯片雜交14-15
• 2.2.8 雜交芯片的清洗、掃描和芯片數(shù)據(jù)提取15
• 2.2.9 芯片數(shù)據(jù)處理15
• 2.2.10 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果15-17
• 2.2.11 差異表達(dá)微小RNA功能富集分析17
• 3 結(jié)果17-24
• 3.1 糖尿病大鼠成模情況17
• 3.2 總RNA質(zhì)檢結(jié)果17-18
• 3.3 微小RNA芯片檢測結(jié)果18-20
• 3.4 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測結(jié)果20-21
• 3.5 差異表達(dá)微小RNA功能富集分析結(jié)果21-24
• 4 討論24-26
• 第二部分 重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子對糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合及微小RNA表達(dá)的影響26-37
• 1 前言26
• 2 材料與方法26-30
• 2.1 材料26-28
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物26-27
• 2.1.2 主要試劑27
• 2.1.3 主要儀器27-28
• 2.2 方法28-30
• 2.2.1 糖尿病大鼠模型的建立28
• 2.2.2 糖尿病大鼠創(chuàng)面模型的建立28
• 2.2.3 觀測指標(biāo)及評價(jià)方法28-29
• 2.2.4 微小RNA差異表達(dá)檢測及驗(yàn)證29-30
• 2.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理30
• 3 結(jié)果30-35
• 3.1 糖尿病大鼠成模情況30
• 3.2 創(chuàng)面愈合情況30-31
• 3.3 組織病理學(xué)觀察31
• 3.4 創(chuàng)面CD31和PCNA抗體表達(dá)31-32
• 3.5 微小RNA差異表達(dá)檢測結(jié)果及驗(yàn)證32-35
• 3.5.1 總RNA抽提及質(zhì)檢32
• 3.5.2 微小RNA芯片檢測結(jié)果32-34
• 3.5.3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測34
• 3.5.4 KEGG信號(hào)通路功能富集分析34-35
• 4 討論35-37
• 全文結(jié)論37-38
• 致謝38-39
• 參考文獻(xiàn)39-42
• 附圖42-50
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果50-51
• 綜述51-63
• 參考文獻(xiàn)58-63

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 徐靜靜;蔡景龍;李毅;宗憲磊;李國菊;李國帥;;真皮支架材料的研究現(xiàn)狀[J];中華創(chuàng)傷雜志;2015年02期

2 劉移峰;劉德伍;毛遠(yuǎn)桂;汪顯林;彭燕;胡洋紅;劉德明;;糖尿病創(chuàng)面與正常創(chuàng)面微小RNA差異表達(dá)譜分析[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2015年01期

3 楊群英;曹瑛;高方;朱波;羅祥蓉;薛耀明;;神經(jīng)肽P物質(zhì)在糖尿病足潰瘍皮膚中的表達(dá)變化[J];中國糖尿病雜志;2014年12期

4 齊昆青;程團(tuán)結(jié);樸金龍;尚祥嶺;;自體血小板凝膠在糖尿病足潰瘍治療中的應(yīng)用研究[J];中國糖尿病雜志;2014年12期

5 弓家弘;陸樹良;;干細(xì)胞治療糖尿病難愈創(chuàng)面研究進(jìn)展[J];中華燒傷雜志;2014年06期

6 杜娟;劉雪來;;表皮干細(xì)胞:治療難愈性皮膚創(chuàng)面的種子細(xì)胞[J];中華損傷與修復(fù)雜志(電子版);2014年06期

7 Margolis DJ;Gupta J;Hoffstad O;沈晶;周波;于淼;;高壓氧療法在治療糖尿病足潰瘍和預(yù)防截肢方面缺乏有效價(jià)值:一項(xiàng)隊(duì)列研究[J];中華糖尿病雜志;2014年10期

8 高建;劉靜;;斂瘡散治療慢性難愈性皮膚潰瘍20例[J];中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育;2014年20期

9 孫舒瑤;王椿;冉興無;;微小RNA在糖尿病創(chuàng)面愈合中的研究進(jìn)展[J];中國修復(fù)重建外科雜志;2014年11期

10 余道江;徐又佳;趙天蘭;謝曉明;陳琦;韓文雅;伍麗君;于文淵;;波動(dòng)式負(fù)壓封閉引流在復(fù)雜創(chuàng)面植皮術(shù)中的應(yīng)用[J];中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志;2014年05期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王忠福;以TriVex旋切術(shù)為中心的三階段療法治療下肢靜脈性潰瘍的臨床療效觀察[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：微小RNA在糖尿病創(chuàng)面中的差異表達(dá)及GM-CSF的干預(yù)作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：495259