本文關(guān)鍵詞：Smurf2對增生性瘢痕TGF-β1信號通路負向調(diào)節(jié)因子Smad7的影響及其機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景創(chuàng)傷修復(fù)過程中成纖維細胞過度增殖，大量分泌細胞外基質(zhì)（ECM)，以及ECM合成與降解失衡等促進了增生性瘢痕的形成。轉(zhuǎn)化生長因子β1（Transforming growth factorβ1，TGF-β1）在這一病理過程中起著重要作用。TGF-β1主要通過細胞內(nèi)Smads蛋白傳遞信號，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程在不同層面上受到多種多樣精確的調(diào)控。其中，抑制性Smad蛋白Smad7是TGF-β1/Smad信號通路的主要負向調(diào)節(jié)因子之一。 泛素-蛋白酶體途徑（Ubiquitin Proteasome Pathway，UPP）是真核細胞中蛋白質(zhì)選擇性降解的重要途徑，廣泛參與如細胞周期、DNA修復(fù)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、吞噬等生理過程，其功能的異常與多種疾病相關(guān)。泛素-蛋白酶體途徑包括泛素蛋白，泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3及26S蛋白酶體。其中，E3泛素連接酶特異性地識別靶蛋白底物，進而引發(fā)蛋白酶體降解蛋白質(zhì)，在蛋白質(zhì)泛素化降解的過程中起著極其重要的作用。 在TGF-β1/Smad信號傳導(dǎo)通路中，E3泛素連接酶通過選擇性介導(dǎo)其關(guān)鍵組分如Smads蛋白、TGF-β受體等的泛素化降解，在TGF-β1/Smad信號活性的調(diào)節(jié)中起樞紐作用，一旦功能失調(diào)，會導(dǎo)致異常的TGF-β1/Smad信號傳導(dǎo)，并引起一系列疾病的病理生理學(xué)改變。Smurf2（Smad ubiquitination regulatory factor2，Smad泛素化調(diào)節(jié)因子2）是E3泛素連接酶的一種，含HECT結(jié)構(gòu)域。最近研究報道，Smurf2在多種纖維化疾病中表達異常，通過泛素化降解Smad7、核轉(zhuǎn)錄抑制因子SnoN（Ski-related novel gene N）、Ski（Sloan-KetteringInstitute proto-oncogene）等影響了TGF-β1信號傳導(dǎo)通路，參與了纖維化疾病的發(fā)生、發(fā)展。 最近，我們的研究顯示：增生性瘢痕組織中Smurf2的表達增強，使用siRNA成功抑制增生性瘢痕成纖維細胞Smurf2的表達后，瘢痕成纖維細胞自分泌TGF-β1減少、I型膠原的合成減少、a-SMA的表達減少，提示Smurf2表達增強與增生性瘢痕的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。但是，在增生性瘢痕中，Smurf2是通過作用于哪一種信號分子來調(diào)節(jié)TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，，尚不清楚。本研究探索E3泛素連接酶Smurf2是否通過降解TGF-β1/Smad信號通路的負向調(diào)節(jié)蛋白Smad7，從而增強TGF-β1信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與了增生性瘢痕的形成。目的探討Smurf2對增生性瘢痕成纖維細胞TGF-β1/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路負向調(diào)節(jié)因子Smad7的影響及調(diào)控機制。 方法（1）以增生性瘢痕成纖維細胞為研究對象，同一個體正常皮膚成纖維細胞作為對照，采用Western Blot檢測兩組細胞中Smad7的蛋白表達水平；（2）加入外源性TGF-β1（10ng/ml）作用5min、15min、30min、1h、2h、12h后，采用RT-PCR和Western Blot分別檢測增生性瘢痕成纖維細胞與正常皮膚成纖維細胞中Smad7的mRNA和蛋白表達水平；（3）收集增生性瘢痕成纖維細胞和正常皮膚成纖維細胞的細胞裂解液，分別加入泛素化混合物于37℃孵育1h、2h、6h，采用Western Blot檢測兩組細胞中Smad7的體外降解水平；（4）收集增生性瘢痕成纖維細胞和正常皮膚成纖維細胞的細胞裂解液，同時加入泛素化混合物及蛋白酶體抑制劑MG132/MG115（50μM/50μM），研究其對Smad7體外降解的抑制作用；（5）利用免疫共沉淀技術(shù)，研究增生性瘢痕成纖維細胞中Smad7與E3泛素連接酶Smurf2是否存在相互作用；（6）采用siRNA干擾技術(shù)沉默增生性瘢痕成纖維細胞中Smurf2的基因表達，研究沉默Smurf2后，增生性瘢痕成纖維細胞中Smad7蛋白在TGF-β1刺激下的表達水平。 結(jié)果（1）在正常皮膚及增生性瘢痕成纖維細胞中，Smad7的蛋白表達水平無明顯差異；（2）在外源性TGF-β1刺激下，正常皮膚成纖維細胞中Smad7mRNA和蛋白表達水平均呈時間依賴性增高，增生性瘢痕成纖維細胞中Smad7mRNA表達呈時間依賴性增加，蛋白水平無明顯變化；（3）正常皮膚成纖維細胞中，Smad7的體外降解無明顯變化，增生性瘢痕成纖維細胞中，Smad7的體外降解增強；（4）蛋白酶體抑制劑MG132/MG115可以阻斷增生性瘢痕成纖維細胞中Smad7的體外降解；（5）在用Smurf2抗體免疫共沉淀下來的蛋白復(fù)合物中檢測到Smad7，表明增生性瘢痕成纖維細胞中Smurf2與Smad7存在相互作用；（6）增生性瘢痕成纖維細胞中，加入TGF-β1刺激，Smad7的蛋白表達水平無明顯變化；沉默Smurf2基因后，Smad7蛋白在TGF-β1刺激下表達增高。 結(jié)論在增生性瘢痕成纖維細胞中，Smurf2可能通過泛素化降解Smad7，削弱了Smad7對TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制作用，從而增強了TGF-β1/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進了增生性瘢痕的形成。
【關(guān)鍵詞】：Smurf2 Smad7 轉(zhuǎn)化生長因子β1 增生性瘢痕
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R641
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-8
• 目錄8-9
• 第一章 前言9-12
• 第二章 實驗方法和材料12-26
• 2.1 實驗樣本12
• 2.2 試劑、耗材及儀器12-18
• 2.3 實驗方法18-25
• 2.4 統(tǒng)計學(xué)處理25-26
• 第三章 實驗結(jié)果26-36
• 3.1 成纖維細胞生長的特點26-27
• 3.2 增生性瘢痕成纖維細胞中 Smad7 蛋白的表達27-28
• 3.3 TGF-β1 刺激下增生性瘢痕成纖維細胞中 Smad7 的表達28-30
• 3.4 增生性瘢痕成纖維細胞中 Smad7 的體外降解30-31
• 3.5 蛋白酶體抑制劑 MG132 / MG115 對 Smad7 體外降解的抑制31-32
• 3.6 免疫共沉淀檢測 Smurf2 與 Smad7 的相互作用32-33
• 3.7 siRNA 沉默 Smurf2 基因表達后增生性瘢痕成纖維細胞中 Smad7 的表達33-36
• 第四章 討論36-43
• 4.1 TGF-β1/Smad 信號通路與創(chuàng)面愈合及增生性瘢痕形成36-38
• 4.2 蛋白質(zhì)的泛素化降解與疾病38-39
• 4.3 E3 泛素連接酶 Smurf2 對 TGF-β1/Smad 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控39-41
• 4.4 結(jié)論41-42
• 4.5 意義42-43
• 參考文獻43-49
• 中英文縮略詞對照表49-50
• 攻讀期間所獲成果50-51
• 致謝51

【參考文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：Smurf2對增生性瘢痕TGF-β1信號通路負向調(diào)節(jié)因子Smad7的影響及其機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：438350