miR-181a-5p在后縱韌帶骨化中的作用和機(jī)制研究
發(fā)布時(shí)間：2022-02-11 12:08
研究背景及目的后縱韌帶骨化（ossification of the posterior longitudinal ligament,簡(jiǎn)稱 OPLL）是一種常見(jiàn)的脊柱韌帶異位骨化（heterotopicossification,簡(jiǎn)稱HO）疾病。由于椎管內(nèi)的空間有限,隨著骨化物的生長(zhǎng),易造成相應(yīng)水平的脊髓或神經(jīng)根受壓損傷,導(dǎo)致肢體感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)功能障礙,嚴(yán)重影響人類的健康與生活質(zhì)量。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),OPLL主要發(fā)生在頸椎和胸椎,該部位所對(duì)應(yīng)的脊髓功能一旦受損,所造成的神經(jīng)功能障礙往往是廣泛的,且對(duì)患者生活質(zhì)量甚至生存時(shí)間造成嚴(yán)重的影響。目前有效的治療方式是通過(guò)手術(shù)切除骨化物直接減壓或通過(guò)擴(kuò)大椎管容積間接減壓解除骨化物對(duì)脊髓的直接壓迫,但該部位手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)高,手術(shù)過(guò)成中由于骨化物與硬脊膜往往存在不同程度的黏連,術(shù)者往往選擇不切除或部分切除骨化物的手術(shù)方式,這也對(duì)術(shù)者的經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)提出了很高的要求。術(shù)后還存在骨化物繼續(xù)生長(zhǎng)甚至生長(zhǎng)加速的情況,使得患者承受二次手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)。相關(guān)的病因?qū)W研究顯示,年齡、肥胖、飲食、糖尿病、運(yùn)動(dòng)或脊柱的異常活動(dòng)所造成的機(jī)械刺激、某些內(nèi)分泌疾病,如甲狀旁腺功能減退、肢端肥大癥等...
【文章來(lái)源】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)上海市211工程院校
【文章頁(yè)數(shù)】：105 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【部分圖文】：
骨化相關(guān)mi R-181是OPLL的潛在致病因子。(A)OPLL相關(guān)mi RNA/m RNA負(fù)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)繪制流程圖。(B)OPLL中與骨化相關(guān)的mi RNA/m RNA交互式網(wǎng)絡(luò)圖。圓形點(diǎn)代表差異表達(dá)的m RNA,圓角矩形點(diǎn)代表差異表達(dá)的mi RNA。OPLL中上調(diào)的基因標(biāo)記為紅色,而下調(diào)的標(biāo)記為綠色。(C)OPLL中表達(dá)量最高的10個(gè)mi RNA列表。(D)通過(guò)實(shí)時(shí)PCR確定mi R-181a在PLL(n=10)和OPLL(n=10)組織中的表達(dá)驗(yàn)證。水平線代表平均值和四分位數(shù)。**P<0.01。
為深入研究miR-181a-5p在后縱韌帶細(xì)胞誘導(dǎo)成骨過(guò)程中的作用,我們從臨床后縱韌帶組織中通過(guò)爬壁法提取后縱韌帶細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),如圖所示,組織塊貼壁培養(yǎng)7-14天后,后縱韌帶細(xì)胞開(kāi)始爬出并逐漸向周圍增殖,鏡下分析可見(jiàn)OPLL與PLL來(lái)源的后縱韌帶細(xì)胞形態(tài)相似,與成纖維細(xì)胞形態(tài)類似,呈梭形,并有少量細(xì)長(zhǎng)偽足(圖1-2A);當(dāng)組織內(nèi)細(xì)胞基本爬出并在培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)匯合至80%密度,常規(guī)消化、傳代,取部分細(xì)胞提取RNA,通過(guò)RT-PCR檢測(cè)miR-181a-5p及miR-181a-3p在兩種細(xì)胞中的表達(dá)含量,結(jié)果顯示OPLL細(xì)胞中miR-181a-5p及miR-181a-3p表達(dá)均顯著高于PLL細(xì)胞,而在兩種細(xì)胞內(nèi),miR-181a-5p表達(dá)含量均顯著高于miR-181a-3p,進(jìn)一步提示miR-181a-5p是OPLL細(xì)胞成骨分化的關(guān)鍵靶基因;此外,為評(píng)估兩種細(xì)胞的成骨能力,消化收集細(xì)胞并按一定密度鋪板于24孔板,12小時(shí)細(xì)胞貼壁后,將普通培養(yǎng)基更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基,分別培養(yǎng)1天、10天、21天收集細(xì)胞,通過(guò)ALP、ARS染色評(píng)估PLL及OPLL來(lái)源的后縱韌帶細(xì)胞成骨能力,結(jié)果顯示,更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)1天時(shí),OPLL、PLL細(xì)胞均無(wú)明顯染色,隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),OPLL、PLL細(xì)胞均被染色且染色深度呈現(xiàn)明顯差別,具體表現(xiàn)為OPLL較PLL細(xì)胞ALP、ARS染色更深(圖1-2C),表明OPLL較PLL細(xì)胞具有更強(qiáng)的成骨表現(xiàn);為進(jìn)一步評(píng)估兩種細(xì)胞成骨能力,采用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)不同時(shí)間后,收集細(xì)胞RNA,通過(guò)RT-PCR檢測(cè)骨化相關(guān)基因(RUNX2、OSX、OPN、ALP)表達(dá),結(jié)果表明,成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)PLL及OPLL細(xì)胞成骨分化一段時(shí)間后,細(xì)胞內(nèi)骨化相關(guān)基因表達(dá)顯著上調(diào),OPLL細(xì)胞較PLL骨化相關(guān)基因表達(dá)變化更為明顯(圖1-2D)。與此同時(shí),為在細(xì)胞層面觀察成骨過(guò)程中miR-181a-5p及miR-181a-3p表達(dá)情況,我們通過(guò)RT-PCR檢測(cè)miR-181a-5p及miR-181a-3p在成骨誘導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn),兩種細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)變化,結(jié)果顯示miR-181a-5p及miR-181a-3p在OPLL細(xì)胞中的表達(dá)量隨成骨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高,增長(zhǎng)幅度方面,miR-181a-5p較miR-181a-3p表達(dá)量升高更為顯著(圖1-2E);而PLL細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)后,miR-181a-5p及miR-181a-3p并未出現(xiàn)明顯改變,miR-181a-5p在誘導(dǎo)21天后表達(dá)量輕度增加,提示miR-181a-5p在PLL細(xì)胞成骨分化中也具有一定作用。(三)mi R-181a-5p/-3p對(duì)后縱韌帶細(xì)胞成骨能力的影響
深入探究miR-181a-5p及miR-181a-3p對(duì)后縱韌帶細(xì)胞成骨分化過(guò)程的影響,分別構(gòu)建miR-181a-5p及miR-181a-3p mimic及inhibitor,通過(guò)基因表達(dá)操作手段研究miR-181a-5p及miR-181a-3p表達(dá)變化對(duì)后縱韌帶細(xì)胞成骨分化的影響,鑒于前期研究發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p及miR-181a-3p在OPLL中高表達(dá),在PLL中相對(duì)低表達(dá),因此,我們計(jì)劃在低表達(dá)的PLL細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-181a-5p及miR-181a-3p,而在高表達(dá)的OPLL細(xì)胞中抑制miR-181a-5p及miR-181a-3p表達(dá)。消化收集PLL細(xì)胞傳至24孔板,分為5組,Blank組不轉(zhuǎn)染,NC組轉(zhuǎn)染Scrambled,miR-181a-5p組轉(zhuǎn)染miR-181a-5p mimic,miR-181a-3p組轉(zhuǎn)染miR-181a-3p mimic,另外采用課題組前期研究證實(shí)在后縱韌帶細(xì)胞成骨分化中發(fā)揮重要作用的miR-10a-3p轉(zhuǎn)染作為陽(yáng)性對(duì)照,48小時(shí)后給予成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21天。分別進(jìn)行ALP染色、茜素紅染色、qRT-PCR、western-blot檢測(cè)。ALP結(jié)果顯示,miR-181a-5p能明顯增強(qiáng)PLL細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后著色,轉(zhuǎn)染miR-181a-3p的PLL細(xì)胞與NC組比較未出現(xiàn)明顯差異(Figure 1-3A)。茜素紅染色結(jié)果顯示miR-181a-5p能明顯增加PLL細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成,miR-181a-3p組與NC組比較未見(jiàn)明顯差異(Figure 1-3B)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與NC組比較,miR-181a-5p組RUNX2、ALP、OPN、OSX表達(dá)明顯升高,miR-181a-3p組骨化相關(guān)基因表達(dá)量未見(jiàn)明顯改變(圖1-3C)。western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-181a-5p可以明顯增加RUNX2、OSX蛋白表達(dá)量,而轉(zhuǎn)染miR-181a-3p無(wú)明顯變化(圖1-3D)。以上結(jié)果表明,miR-181a-5p對(duì)PLL細(xì)胞成骨分化具有重要調(diào)控作用,而miR-181a-3p則沒(méi)有相應(yīng)功能。2、干擾miR-181a-5p/3p對(duì)OPLL細(xì)胞成骨能力的影響
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]miR-144-3p在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中的表達(dá)及其靶向調(diào)控作用[J]. 陸進(jìn),張浩軒,俞鵬,龔義鳳,龔喜旺,范強(qiáng)強(qiáng),楊月. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2018(09)
[2]TGF-β/BMP signaling and other molecular events: regulation of osteoblastogenesis and bone formation[J]. Md Shaifur Rahman,Naznin Akhtar,Hossen Mohammad Jamil,Rajat Suvra Banik,Sikder M Asaduzzaman. Bone Research. 2015(01)
本文編號(hào)：3620251
【文章來(lái)源】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)上海市211工程院校
【文章頁(yè)數(shù)】：105 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【部分圖文】：
骨化相關(guān)mi R-181是OPLL的潛在致病因子。(A)OPLL相關(guān)mi RNA/m RNA負(fù)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)繪制流程圖。(B)OPLL中與骨化相關(guān)的mi RNA/m RNA交互式網(wǎng)絡(luò)圖。圓形點(diǎn)代表差異表達(dá)的m RNA,圓角矩形點(diǎn)代表差異表達(dá)的mi RNA。OPLL中上調(diào)的基因標(biāo)記為紅色,而下調(diào)的標(biāo)記為綠色。(C)OPLL中表達(dá)量最高的10個(gè)mi RNA列表。(D)通過(guò)實(shí)時(shí)PCR確定mi R-181a在PLL(n=10)和OPLL(n=10)組織中的表達(dá)驗(yàn)證。水平線代表平均值和四分位數(shù)。**P<0.01。
為深入研究miR-181a-5p在后縱韌帶細(xì)胞誘導(dǎo)成骨過(guò)程中的作用,我們從臨床后縱韌帶組織中通過(guò)爬壁法提取后縱韌帶細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),如圖所示,組織塊貼壁培養(yǎng)7-14天后,后縱韌帶細(xì)胞開(kāi)始爬出并逐漸向周圍增殖,鏡下分析可見(jiàn)OPLL與PLL來(lái)源的后縱韌帶細(xì)胞形態(tài)相似,與成纖維細(xì)胞形態(tài)類似,呈梭形,并有少量細(xì)長(zhǎng)偽足(圖1-2A);當(dāng)組織內(nèi)細(xì)胞基本爬出并在培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)匯合至80%密度,常規(guī)消化、傳代,取部分細(xì)胞提取RNA,通過(guò)RT-PCR檢測(cè)miR-181a-5p及miR-181a-3p在兩種細(xì)胞中的表達(dá)含量,結(jié)果顯示OPLL細(xì)胞中miR-181a-5p及miR-181a-3p表達(dá)均顯著高于PLL細(xì)胞,而在兩種細(xì)胞內(nèi),miR-181a-5p表達(dá)含量均顯著高于miR-181a-3p,進(jìn)一步提示miR-181a-5p是OPLL細(xì)胞成骨分化的關(guān)鍵靶基因;此外,為評(píng)估兩種細(xì)胞的成骨能力,消化收集細(xì)胞并按一定密度鋪板于24孔板,12小時(shí)細(xì)胞貼壁后,將普通培養(yǎng)基更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基,分別培養(yǎng)1天、10天、21天收集細(xì)胞,通過(guò)ALP、ARS染色評(píng)估PLL及OPLL來(lái)源的后縱韌帶細(xì)胞成骨能力,結(jié)果顯示,更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)1天時(shí),OPLL、PLL細(xì)胞均無(wú)明顯染色,隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),OPLL、PLL細(xì)胞均被染色且染色深度呈現(xiàn)明顯差別,具體表現(xiàn)為OPLL較PLL細(xì)胞ALP、ARS染色更深(圖1-2C),表明OPLL較PLL細(xì)胞具有更強(qiáng)的成骨表現(xiàn);為進(jìn)一步評(píng)估兩種細(xì)胞成骨能力,采用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)不同時(shí)間后,收集細(xì)胞RNA,通過(guò)RT-PCR檢測(cè)骨化相關(guān)基因(RUNX2、OSX、OPN、ALP)表達(dá),結(jié)果表明,成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)PLL及OPLL細(xì)胞成骨分化一段時(shí)間后,細(xì)胞內(nèi)骨化相關(guān)基因表達(dá)顯著上調(diào),OPLL細(xì)胞較PLL骨化相關(guān)基因表達(dá)變化更為明顯(圖1-2D)。與此同時(shí),為在細(xì)胞層面觀察成骨過(guò)程中miR-181a-5p及miR-181a-3p表達(dá)情況,我們通過(guò)RT-PCR檢測(cè)miR-181a-5p及miR-181a-3p在成骨誘導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn),兩種細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)變化,結(jié)果顯示miR-181a-5p及miR-181a-3p在OPLL細(xì)胞中的表達(dá)量隨成骨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高,增長(zhǎng)幅度方面,miR-181a-5p較miR-181a-3p表達(dá)量升高更為顯著(圖1-2E);而PLL細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)后,miR-181a-5p及miR-181a-3p并未出現(xiàn)明顯改變,miR-181a-5p在誘導(dǎo)21天后表達(dá)量輕度增加,提示miR-181a-5p在PLL細(xì)胞成骨分化中也具有一定作用。(三)mi R-181a-5p/-3p對(duì)后縱韌帶細(xì)胞成骨能力的影響
深入探究miR-181a-5p及miR-181a-3p對(duì)后縱韌帶細(xì)胞成骨分化過(guò)程的影響,分別構(gòu)建miR-181a-5p及miR-181a-3p mimic及inhibitor,通過(guò)基因表達(dá)操作手段研究miR-181a-5p及miR-181a-3p表達(dá)變化對(duì)后縱韌帶細(xì)胞成骨分化的影響,鑒于前期研究發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p及miR-181a-3p在OPLL中高表達(dá),在PLL中相對(duì)低表達(dá),因此,我們計(jì)劃在低表達(dá)的PLL細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-181a-5p及miR-181a-3p,而在高表達(dá)的OPLL細(xì)胞中抑制miR-181a-5p及miR-181a-3p表達(dá)。消化收集PLL細(xì)胞傳至24孔板,分為5組,Blank組不轉(zhuǎn)染,NC組轉(zhuǎn)染Scrambled,miR-181a-5p組轉(zhuǎn)染miR-181a-5p mimic,miR-181a-3p組轉(zhuǎn)染miR-181a-3p mimic,另外采用課題組前期研究證實(shí)在后縱韌帶細(xì)胞成骨分化中發(fā)揮重要作用的miR-10a-3p轉(zhuǎn)染作為陽(yáng)性對(duì)照,48小時(shí)后給予成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21天。分別進(jìn)行ALP染色、茜素紅染色、qRT-PCR、western-blot檢測(cè)。ALP結(jié)果顯示,miR-181a-5p能明顯增強(qiáng)PLL細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后著色,轉(zhuǎn)染miR-181a-3p的PLL細(xì)胞與NC組比較未出現(xiàn)明顯差異(Figure 1-3A)。茜素紅染色結(jié)果顯示miR-181a-5p能明顯增加PLL細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成,miR-181a-3p組與NC組比較未見(jiàn)明顯差異(Figure 1-3B)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與NC組比較,miR-181a-5p組RUNX2、ALP、OPN、OSX表達(dá)明顯升高,miR-181a-3p組骨化相關(guān)基因表達(dá)量未見(jiàn)明顯改變(圖1-3C)。western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-181a-5p可以明顯增加RUNX2、OSX蛋白表達(dá)量,而轉(zhuǎn)染miR-181a-3p無(wú)明顯變化(圖1-3D)。以上結(jié)果表明,miR-181a-5p對(duì)PLL細(xì)胞成骨分化具有重要調(diào)控作用,而miR-181a-3p則沒(méi)有相應(yīng)功能。2、干擾miR-181a-5p/3p對(duì)OPLL細(xì)胞成骨能力的影響
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]miR-144-3p在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中的表達(dá)及其靶向調(diào)控作用[J]. 陸進(jìn),張浩軒,俞鵬,龔義鳳,龔喜旺,范強(qiáng)強(qiáng),楊月. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2018(09)
[2]TGF-β/BMP signaling and other molecular events: regulation of osteoblastogenesis and bone formation[J]. Md Shaifur Rahman,Naznin Akhtar,Hossen Mohammad Jamil,Rajat Suvra Banik,Sikder M Asaduzzaman. Bone Research. 2015(01)
本文編號(hào)：3620251
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