本文關(guān)鍵詞：大鼠頸椎骨折錯(cuò)位脊髓損傷模型的行為學(xué)和組織學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：1.研究背景 在臨床上常見(jiàn)骨折脫位后脊髓剪切導(dǎo)致的急性脊髓損傷,其中頸脊髓損傷占17.75%～50%。目前脊髓損傷的動(dòng)物研究多采用嚙齒類動(dòng)物,主要模型有切割、挫傷、壓迫等。2005年Fiford首次研究了胸椎橫向骨折錯(cuò)位對(duì)脊髓損傷的原發(fā)性損傷的影響。加拿大學(xué)者choo于2007年首次建立了脊柱骨折錯(cuò)位脫位脊髓損傷模型,發(fā)現(xiàn)C4和C5骨折錯(cuò)位2.5mm下的脊髓原發(fā)性損傷與挫傷導(dǎo)致的脊髓損傷不同。Shahrokni研究了該種模型在C5/6水平骨折錯(cuò)位1.50mm后大鼠頸椎固定的生物力學(xué),但是并沒(méi)有脊髓損傷的組織學(xué)和行為學(xué)的研究。 我們前期研究了C4-C5骨折錯(cuò)位1.3,1.6和1.9mm的大鼠原發(fā)性脊髓損傷,所以本課題進(jìn)一步研究其繼發(fā)性損傷,包括傷后8周內(nèi)的組織學(xué)改變和行為學(xué)特點(diǎn)。從行為學(xué)組織病理學(xué)兩方面對(duì)該模型進(jìn)行分級(jí),為該模型的應(yīng)用研究提供基礎(chǔ)。 2.研究目的 本課題將建立不同頸椎骨折錯(cuò)位位移的大鼠原發(fā)性脊髓損傷模型,并在此基礎(chǔ)上分析不同錯(cuò)位位移下的脊髓損傷大鼠的行為學(xué)改變和組織學(xué)特點(diǎn)。 3.研究設(shè)計(jì) 本研究共采用42只雄性SD大鼠(體重300g左右),根據(jù)C4/5錯(cuò)位位移分為對(duì)照組,1.65mm組和1.80mm組,分兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行研究,即原發(fā)性損傷研究(損傷后即刻處死)和繼發(fā)性損傷研究(8周觀察)。 3.1不同錯(cuò)位位移下的脊髓原發(fā)性損傷研究 本部分使用18只雄性SD大鼠,體重300g～335g,隨機(jī)分為頸椎骨折錯(cuò)位1.65mm組,頸椎骨折錯(cuò)位1.80mm組和對(duì)照組,每組6只。磨鉆去除C4/5雙側(cè)小關(guān)節(jié)。頭側(cè)椎夾置于C2(下1/2)、C3和C4兩側(cè)溝槽(關(guān)節(jié)突與橫突間)中,尾側(cè)椎夾置于C5、C6和部分C7的兩側(cè)溝槽內(nèi)。頭側(cè)椎夾固定于大鼠腦立體定位儀上,尾側(cè)椎夾連接到Instron單軸電磁伺服試驗(yàn)機(jī),以200mm/s速度向背側(cè)提升尾側(cè)椎夾1.65mm或者1.80mm,停留0.3s,然后以2mm/s的速度回到原位。試驗(yàn)機(jī)記錄實(shí)驗(yàn)組損傷過(guò)程中的力和位移。 即刻灌注取材,樣本大體觀察和冰凍矢狀位切片HE染色,計(jì)算脊髓白質(zhì)出血量、灰質(zhì)出血量、以及總出血量。 3.2不同錯(cuò)位位移下的頸髓繼發(fā)性損傷研究 本部分使用24只雄性大鼠,體重288-330g,分對(duì)照組(n=6),1.65mm組(n=9)和1.80mm組(n=9)。進(jìn)行相應(yīng)骨折錯(cuò)位后,固定夾固定頸椎,飼養(yǎng)8周,進(jìn)行行為學(xué)和組織學(xué)觀察。 3.2.1行為學(xué)研究 前肢運(yùn)動(dòng)評(píng)分：FLS (Forelimb locomotor score)評(píng)分,在術(shù)前1天,術(shù)后第3和7天,以及術(shù)后第1至8周進(jìn)行開(kāi)場(chǎng)環(huán)境下錄像,用FLS評(píng)分評(píng)價(jià)大鼠脊髓損傷后的上肢功能改變。 梳理實(shí)驗(yàn)：在術(shù)前1天,術(shù)后1-8周,每周一次誘發(fā)大鼠自主梳理,進(jìn)行錄像,評(píng)價(jià)大鼠上肢運(yùn)動(dòng)范圍。 抓力試驗(yàn)：在術(shù)前適應(yīng)一周后,術(shù)前1天測(cè)量基線值,術(shù)后第4天,以及術(shù)后第1至8周時(shí)分別測(cè)量大鼠的左、右上肢拉力,評(píng)價(jià)前肢肌力變化。 3.2.2組織學(xué)研究 灌注取材 在術(shù)后8周,即試驗(yàn)終點(diǎn)時(shí),過(guò)量麻醉處死大鼠,多聚甲醛心臟灌注,取C4/5為中心的長(zhǎng)約7mm頸段脊髓,蔗糖溶液梯度脫水,干冰速凍,-80℃保存。 行脊髓橫斷面切片,厚度20μm,間隔400μ m,取其中10套切片待用,-80℃保存。隨機(jī)抽取4套,分別做HE染色觀察脊髓大體形態(tài),LFB髓鞘染色檢測(cè)脊髓損傷后脫髓鞘情況,NISSL染色計(jì)數(shù)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目,以及GFAP免疫組化染色分析膠質(zhì)反應(yīng)情況。 4.結(jié)果 4.1不同錯(cuò)位位移下的原發(fā)性脊髓損傷研究 1.65mm組的大鼠頸椎骨折錯(cuò)位最大力(可視為頸椎間盤斷裂時(shí)的拉力)為(16.45±3.56)N,1.80mm組為(15.57±5.73)N。1.65mm組和1.80mmm組的錯(cuò)位速度分別為(199.4±1.7)mm/s和(201.5±2.0)mm/s。 兩組最大力的差異沒(méi)有顯著性(P=0.756)。兩組的實(shí)際位移均極為接近目標(biāo)位移。1.80mm組速度與1.65mm組速度兩組間差異無(wú)顯著性(P=0.084)。 脊髓出血量計(jì)算：1.65mm組和1.80mm組兩組的白質(zhì)出血量分別為(0.01±0.02)mm3和(0.09±0.05)mm3,兩組的灰質(zhì)出血量為(0.58±0.15)mm3和(0.88±0.21)mm3,灰質(zhì)和白質(zhì)出血量?jī)山M之間差異均有顯著性(P自質(zhì)=0.013,P灰質(zhì)=0.017)。 4.2不同錯(cuò)位位移下的頸髓繼發(fā)性損傷研究 行為學(xué) 前肢運(yùn)動(dòng)功能FLS評(píng)分：1.65mm組和1.80mm組術(shù)后第1天均表現(xiàn)為無(wú)或僅有一個(gè)關(guān)節(jié)輕微活動(dòng),FLS評(píng)分分別為(0.8±0.4)和(0.2±0.4),組間差異無(wú)顯著性(P=0.810)。術(shù)后1周時(shí),1.65mm組的評(píng)分分別為(3.0±1.9),有兩個(gè)關(guān)節(jié)(即肩關(guān)節(jié),肘關(guān)節(jié))的輕微運(yùn)動(dòng),而1.80mm組的評(píng)分(6.5±3.0),有兩個(gè)關(guān)節(jié)(肩關(guān)節(jié),肘關(guān)節(jié))的中度活動(dòng)有或無(wú)腕關(guān)節(jié)的輕微活動(dòng)。大鼠脊髓損傷后,前肢運(yùn)動(dòng)功能在1-2周內(nèi)恢復(fù)最快,在第3周時(shí)達(dá)到一個(gè)恢復(fù)平臺(tái),評(píng)分分別為(12.2±1.5)和(10.6±1.5),而后仍有少許恢復(fù)。1.65mm組和1.80mm組在術(shù)后第8周時(shí)前肢評(píng)分分別為(14.3±0.7)和(12.1±0.9)。除第1天外的各時(shí)間點(diǎn)上兩組評(píng)分的差異均有顯著性。 梳理實(shí)驗(yàn)：1.65mm組和1.80mmm組術(shù)后1周評(píng)分最低,評(píng)分分別為(1.4±0.7和(1.1±0.8)。在術(shù)后第8周時(shí),評(píng)分分別為(3.4±0.5)和(3.3±0.7),大鼠前肢最大梳理范圍達(dá)眼框附近。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn),兩組間評(píng)分差異均無(wú)顯著性。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組為滿分5分。 前肢拉力：術(shù)前對(duì)照組、1.65mm組和1.80mmm組的拉力分別為(1.64±0.08)N、(1.59±0.11)N和(1.63±0.08)N。1.65mmm組和1.80mm組術(shù)后1周內(nèi)表現(xiàn)爪子痙攣或者無(wú)力狀態(tài),在第1周時(shí)有輕微抓力,分別為(0.49±0.18)N和(0.83±0.13)N,兩組間的差異有顯著性(p0.05)。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組術(shù)后第1周的拉力為(1.44±0.20)N。1.65mm組和1.80mmm組從第1周后隨時(shí)間逐漸恢復(fù),在第8周時(shí)分別為(1.55±0.24)N和(1.39±0.16)N,均小于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(1.87±0.13)N。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上,三組的左、右側(cè)拉力的差異無(wú)顯著性,說(shuō)明脊髓損傷的對(duì)稱性較好。 組織學(xué)結(jié)果 脊髓損傷后,逐漸形成空洞囊腔,脊髓萎縮,HE染色照片可以觀察到脊髓明顯萎縮變小。脊髓損傷8周時(shí),1.65mm組脊髓損傷中心處脊髓殘留面積為(3.24±0.82)mm2,1.80mm組為(2.15±0.51)mm2。1.65mm組以損傷處為中心的長(zhǎng)度為4mm的脊髓體積為(18.07±2.31)mm3,1.80mmm組為(16.01±2.34)mm3,對(duì)照組為(25.38±1.05)mm3。三組間脊髓體積的差異均有顯著性。骨折錯(cuò)位越大,損傷程度越重,脊髓殘留體積越小。 脊髓損傷第8周時(shí),GFAP免疫組化染色后的組織切片上可見(jiàn)灰質(zhì)和白質(zhì)中均膠質(zhì)細(xì)胞明顯增生,特別是在空洞囊腔的邊緣可見(jiàn)大量膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn),呈灶性聚集分布。白質(zhì)和灰質(zhì)中膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)胞體變大,突觸減少。1.80mmm組可見(jiàn)膠質(zhì)反應(yīng)明顯重于1.65mmm組。對(duì)照組的膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)小,白質(zhì)中神經(jīng)小膠質(zhì)數(shù)目少,胞體小,突觸細(xì)長(zhǎng),未見(jiàn)明顯的膠質(zhì)活性增生及其他異常等。 脊髓脫髓鞘,在Luxol fast blue染色切片上,計(jì)算以脊髓損傷中心為中點(diǎn),頭、尾端各2mm,4mm長(zhǎng)的脊髓共計(jì)11片切片上的髓鞘LFB染色的總IOD值。對(duì)照組總IOD值為(2.87±0.34)x105,1.65mm組為(1.14±0.33)x105,而1.80mm組為(0.54±0.30)x105。1.65mm組和1.80mm組均與對(duì)照組的差異均有顯著性(P=0.000),而1.65mm組的總IOD值大于1.80mm組(P=0.027)。結(jié)果表明：骨折錯(cuò)位位移越大,脊髓白質(zhì)髓鞘脫失越嚴(yán)重。距離脊髓損傷中心尾端1.6mm處的脊髓切片為例,可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組在脊髓損傷區(qū)域的尾端的背側(cè)和腹側(cè)的髓鞘均有明顯脫失。而1.80mm組不論在脊髓背側(cè)還是腹側(cè)的髓鞘脫失都比1.65mm組嚴(yán)重。 尼氏染色后,在脊髓損傷中心神經(jīng)元細(xì)胞的丟失最為明顯,該處1.65mm組和1.80mm組的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元幾乎被破壞殆盡。距頭尾端2mm的脊髓,1.65mm組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目少于1.80mm組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.045).以距離損傷中心1.2mm為例,1.80mm組在脊髓前角上部�？梢�(jiàn)明顯增生的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞聚集,可見(jiàn)明顯神經(jīng)元細(xì)胞固縮變形或胞體淡染,縮小呈空泡狀；而1.65mm組神經(jīng)元數(shù)目明顯多于1.80mm組,神經(jīng)元變性也較1.80mm組少。 5.結(jié)論 本研究成功建立了大鼠頸椎骨折錯(cuò)位脊髓繼發(fā)性損傷模型,證實(shí)大鼠C4/5骨折錯(cuò)位1.65mm和1.80mm可造成不同損傷程度的脊髓損傷,繼發(fā)性損傷表現(xiàn)為殘留一定的前肢運(yùn)動(dòng)功能障礙,脊髓組織出現(xiàn)萎縮、灰質(zhì)和白質(zhì)破壞,形成空洞。本模型是一種臨床相關(guān)的頸脊髓損傷的新模型,可用于脊髓損傷機(jī)制和治療評(píng)價(jià)的研究。
【關(guān)鍵詞】：脊髓損傷 大鼠頸椎 骨折錯(cuò)位 行為學(xué) 組織學(xué)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R651.15;R-332
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 第1章 前言17-23
• 1. 脊髓損傷流行病學(xué)17-19
• 2. 頸髓損傷病理特點(diǎn)19
• 3. 脊髓損傷的治療研究進(jìn)展19-21
• 4. 頸髓損傷動(dòng)物模型21-23
• 第2章 不同錯(cuò)位位移下的原發(fā)性脊髓損傷研究23-35
• 1. 材料和方法23-30
• 2. 結(jié)果30-32
• 3. 討論32-34
• 4. 結(jié)論34-35
• 第3章 不同位移下脊髓繼發(fā)性損傷的組織學(xué)和行為學(xué)特點(diǎn)35-65
• 1. 材料與方法35-43
• 2. 結(jié)果43-59
• 3. 討論59-64
• 4. 結(jié)論64-65
• 參考文獻(xiàn)65-71
• 攻讀碩士期間科研成果71-72
• 致謝72-73

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