研究背景:嚴(yán)重?zé)齻�、�?chuàng)傷、高原低氧環(huán)境以及其它原因引起的心臟缺氧,都可導(dǎo)致心肌損害。如嚴(yán)重?zé)齻?由于強(qiáng)烈的應(yīng)激和有效循環(huán)血容量減少,心肌可因局部血流灌注不足而發(fā)生缺氧。心臟作為高耗能循環(huán)動(dòng)力器官,心肌易受缺氧影響而出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷,并最終誘發(fā)或加重?zé)齻菘?增加嚴(yán)重?zé)齻∷缆�。因�?心肌缺氧損害已成為臨床救治嚴(yán)重?zé)齻?chuàng)傷等病人不可忽視的問(wèn)題,闡明缺氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損害及其發(fā)生機(jī)制具有重要的臨床意義。自噬是進(jìn)化上保守且依賴于溶酶體系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)降解途徑,在生理?xiàng)l件下,自噬通過(guò)降解細(xì)胞內(nèi)的長(zhǎng)壽命蛋白和老化受損細(xì)胞器來(lái)維持細(xì)胞的正常功能。然而,當(dāng)自噬過(guò)程即自噬流受損時(shí),細(xì)胞會(huì)因降解底物堆積和營(yíng)養(yǎng)供給障礙而死亡。近期研究顯示,自噬流受損是多種病理因素導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙甚至死亡的重要途徑。因此,嚴(yán)重?zé)齻�、�?chuàng)傷等引起的缺氧可能通過(guò)損傷自噬流導(dǎo)致心肌細(xì)胞損害,但其具體作用及機(jī)制目前尚不清楚。己糖激酶是糖酵解第一步反應(yīng)的限速酶,在哺乳動(dòng)物中,己糖激酶以四種亞型存在于不同組織細(xì)胞,在心肌細(xì)胞中主要是己糖激酶Ⅱ。研究顯示,缺氧可上調(diào)己糖激酶Ⅱ的表達(dá)水平,并導(dǎo)致小鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷。另有研究顯示,在無(wú)糖饑餓時(shí),己糖激酶Ⅱ參與大鼠心肌細(xì)胞自噬的調(diào)控。因此,我們推測(cè),己糖激酶Ⅱ可能介導(dǎo)了缺氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞自噬流受損。MTORC1是細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在饑餓條件下,其活性可迅速被抑制從而引發(fā)自噬,隨后其活性又被自噬產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)再次激活從而終止自噬。因而,MTORC1是調(diào)節(jié)自噬的重要“開(kāi)關(guān)”。然而,缺氧條件下,己糖激酶Ⅱ是否通過(guò)MTORC1調(diào)控心肌細(xì)胞自噬流,目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。因此,本研究提出缺氧條件下己糖激酶Ⅱ通過(guò)MTORC1損傷自噬流進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷的假設(shè),通過(guò)體外構(gòu)建缺氧模型以及調(diào)控己糖激酶Ⅱ的活性和表達(dá),明確己糖激酶Ⅱ在缺氧導(dǎo)致小鼠心肌細(xì)胞自噬流受損中的作用及其機(jī)制。研究方法:取6只1~2 d齡雌雄不限C57BL/6小鼠,分離心臟并培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞,并取原代細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):1.將細(xì)胞隨機(jī)分為6組,即正常對(duì)照3、6、9 h組及缺氧3、6、9 h組。DMEM-F12培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)48 h后,各正常對(duì)照組更換新鮮DMEM-F12培養(yǎng)基后分別培養(yǎng)3、6、9 h,各缺氧組更換無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)基后于37℃低氧培養(yǎng)箱(1%氧氣、5%二氧化碳)內(nèi)分別培養(yǎng)3、6、9 h。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62和己糖激酶Ⅱ的表達(dá)情況,CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。2.將細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組、單純?nèi)毖? h組和缺氧9 h+2-DG組。常規(guī)培養(yǎng)48h后,正常對(duì)照組更換新鮮DMEM-F12培養(yǎng)基后培養(yǎng)9 h,單純?nèi)毖? h組更換無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)基,缺氧9 h+2-DG組更換溶有2-DG(物質(zhì)的量濃度為10 mmol/L)的無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)基,2組均缺氧培養(yǎng)9 h。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和p62的表達(dá)情況,透射電鏡法觀察細(xì)胞自噬體/自噬溶酶體情況,CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。3.將細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組、單純?nèi)毖? h組、缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA1組和缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2組。正常對(duì)照組和單純?nèi)毖? h組常規(guī)培養(yǎng)48 h,其余兩組分別轉(zhuǎn)染200 nmol/L HK-ⅡsiRNA1和HK-ⅡsiRNA2后常規(guī)培養(yǎng)48 h。正常對(duì)照組更換新鮮DMEM-F12培養(yǎng)基后培養(yǎng)9 h,其余三組更換無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)基后缺氧培養(yǎng)9 h。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62和己糖激酶Ⅱ的表達(dá)情況,CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。4.細(xì)胞分組及處理同方法1,蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)反映MTORC1活性的磷酸化的p70S6K和4E-BP1的表達(dá)情況;細(xì)胞分組及處理同方法2,蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)磷酸化的p70S6K和4E-BP1的表達(dá)情況;細(xì)胞分組及處理同方法3,蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)磷酸化的p70S6K和4E-BP1的表達(dá)情況。結(jié)果:1.與對(duì)應(yīng)正常對(duì)照3、6、9 h組比較,缺氧3、6、9 h組細(xì)胞反映自噬流是否通暢的指標(biāo)LC3Ⅱ/Ⅰ比值和p62表達(dá)水平均顯著增加,細(xì)胞活力顯著降低,己糖激酶Ⅱ表達(dá)水平顯著增加。2.與正常對(duì)照組比較,單純?nèi)毖? h組細(xì)胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值及p62表達(dá)水平明顯增加,自噬體/自噬溶酶體堆積,細(xì)胞活力明顯降低;與單純?nèi)毖? h組比較,缺氧9 h+2-DG組細(xì)胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值及p62表達(dá)水平明顯減少,自噬體/自噬溶酶體堆積情況明顯改善,細(xì)胞活力明顯增加。3.與正常對(duì)照組比較,單純?nèi)毖? h組細(xì)胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值與p62、己糖激酶Ⅱ表達(dá)水平均顯著增加,細(xì)胞活力顯著降低;與單純?nèi)毖? h組比較,缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA1組和缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2組細(xì)胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值與p62、己糖激酶Ⅱ表達(dá)水平均顯著減少,細(xì)胞活力顯著增加。4.與對(duì)應(yīng)正常對(duì)照組比較,缺氧各組細(xì)胞磷酸化的p70S6K和4E-BP1表達(dá)水平明顯降低;與單純?nèi)毖? h組相比,缺氧9 h+2-DG組細(xì)胞磷酸化的p70S6K和4E-BP1表達(dá)水平明顯增加;與單純?nèi)毖? h組相比,缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA1組和缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2組細(xì)胞磷酸化的p70S6K和4E-BP1表達(dá)水平明顯增加。結(jié)論:缺氧后,心肌細(xì)胞己糖激酶Ⅱ表達(dá)增加,通過(guò)抑制MTORC1的活性,引起自噬流受損,最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞活力下降。抑制己糖激酶Ⅱ的活性或其表達(dá)可減輕心肌細(xì)胞缺氧損害。該結(jié)論為臨床防治嚴(yán)重?zé)齻笕毖鯇?dǎo)致的心肌細(xì)胞損害提供了新思路,也為創(chuàng)傷、高原低氧環(huán)境以及其他原因引起的心肌缺氧損害防治提供了參考。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R644
【部分圖文】：

陸軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文個(gè)指標(biāo)來(lái)判斷自噬流是否通暢[30]。結(jié)果顯示，與對(duì)應(yīng)正常對(duì)照 3、6、9 h 組比較， 3、6、9 h 組心肌細(xì)胞 LC3Ⅱ/Ⅰ比值顯著增加（n=3； P<0.01），p62 表達(dá)水平顯著（n=3；P<0.01），提示缺氧可導(dǎo)致心肌細(xì)胞自噬流受損（圖 2-1，A，B 和 C）。

圖 2-1 缺氧對(duì)小鼠心肌細(xì)胞自噬流的影響 3 h 組，2. 缺氧 3 h 組，3. 正常對(duì)照 6 h 組，4. 缺氧 6 小鼠心肌細(xì)胞活力的影響表法將原代小鼠心肌細(xì)胞分為 6 組，即正常對(duì)照 3過(guò) CCK-8 法對(duì)各組細(xì)胞的活力進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，缺氧 3、6、9 h 組心肌細(xì)胞活力均有不同程度下降肌細(xì)胞活力下降（圖 2-2）。

陸軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文組及缺氧 3、6、9 h 組。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞己糖激酶Ⅱ的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對(duì)應(yīng)正常對(duì)照 3、6、9 h 組比較，缺氧 3、6、9 h 組心肌細(xì)胞己糖激酶Ⅱ的表達(dá)水平明顯增加（n=3；P<0.01），提示缺氧可上調(diào)小鼠心肌細(xì)胞己糖激酶Ⅱ的表達(dá)水平（圖 2-3，A 和 B）。
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