[目的]通過構建脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導的大鼠H9c2心肌細胞為炎癥模型,從細胞和分子層面探討天麻素對H9c2心肌細胞炎癥的抑制作用及其信號機制。 [方法]體外培養(yǎng)的大鼠H9c2心肌細胞隨機分為空白對照組、LPS (1μg/ml,30min-12h)處理組、不同濃度的天麻素(5、10和20μM,1h)+LPS處理組、不同濃度的天麻素+LPS+wortmannin (1μM)共同處理組和陽性對照組。采用四甲基偶氮唑藍比色法(MTT)檢測天麻素、LPS以及wortmannin對H9C2心肌細胞的活力影響；采用免疫熒光雙標記檢測方法(double-immunofluorescence labeling assay)在熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)和白介素-6(interleukin-6, IL-6)蛋白水平的變化；應用逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測iNOS、COX-2、TNF-α和IL-6的mRNA水平的變化；采用蛋白質(zhì)印跡分析方法(western blotting)檢測蛋白激酶B (protein kinase B, Akt)、抑制劑κB (inhibitor κB,IκB)、促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)家族的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2, ERK1/2)、 c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinases, JNK)和p38促分裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activated protein kinases, p38MAPK)等細胞信號通路蛋白的表達及其變化規(guī)律：采用凝膠遷移或電泳遷移率實驗(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)檢測核因子-κB (nuclear factor-κB,NF-κB)的蛋白表達水平。 [結果]H9c2心肌細胞以1×106個/ml濃度接種于6孔板中,當密度均勻生長至80%時,使用MTT檢測H9c2心肌細胞活力影響,結果顯示：經(jīng)天麻素(5、10和20μM)、 LPS (1μg/ml)和wortmannin (1μM)分別處理或共同處理12h后該細胞活性均無明顯影響；加入P13-K抑制劑wortmannin (1μM)1h后,再加入天麻素和LPS處理細胞30min-3h,采用免疫熒光雙標記檢測方法、RT-PCR、 EMSA以及western blotting分析,得到結果：①不同濃度的天麻素明顯激活H9c2心肌細胞PI3-K/Akt的磷酸化表達；②不同濃度的天麻素通過PI3-K/Akt信號通路在轉錄水平和翻譯水平明顯抑制LPS誘導的H9c2心肌細胞促炎性蛋白酶iNOS和COX-2的表達；③不同濃度的天麻素激活PI3-K/Akt信號通路下調(diào)LPS誘導的H9C2心肌細胞促炎性細胞因子TNF-a和IL-6在mRNA水平和蛋白水平的表達；④天麻素通過PI3-K/Akt信號通路抑制LPS誘導的H9c2心肌細胞NF-κB的激活；⑤天麻素激活PI3-K/Akt信號通路抑制LPS誘導的H9c2心肌細胞IκB、 ERK1/2、 JNK和p38MAPK的磷酸化。 [結論]①5-20gM的天麻素、1μg/ml的LPS和1μM wortmannin的對細胞活性沒有影響；②天麻素通過PI3-K/Akt信號通路抑制MAPKs的磷酸化來調(diào)控LPS誘導的H9c2心肌細胞內(nèi)促炎性蛋白酶以及促炎性細胞因子的釋放;③天麻素激活PI3-K/Akt信號通路抑制IκB的磷酸化和NF-κB的活化,從而發(fā)揮天麻素下調(diào)LPS誘導的H9c2心肌細胞的抗炎作用。
【學位單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2013
【中圖分類】：R459.7
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【共引文獻】

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本文編號：2832133