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PPAR-γ受體介導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞向M2亞型極化對顱腦創(chuàng)傷預(yù)后的影響

發(fā)布時間:2020-09-16 15:28
   顱腦創(chuàng)傷(TBI)是威脅人類健康的主要疾病之一,目前仍無特效的治療措施。顱腦創(chuàng)傷的病理過程分為原發(fā)傷和繼發(fā)傷,原發(fā)性損傷發(fā)生在損傷即刻,無法進行干預(yù),而繼發(fā)性損傷發(fā)生在損傷之后數(shù)分鐘至數(shù)周,由多種細胞因子和炎癥因子介導(dǎo),可以進行干預(yù)。越來越多的研究表明小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在繼發(fā)性顱腦損傷中起著重要作用。目前文獻將激活的小膠質(zhì)細胞分為兩種亞型:M1型,具有促炎作用,M2型,具有抑炎作用。通過抑制小膠質(zhì)細胞向M1型極化,促進其向M2型極化已經(jīng)在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病動物模型中顯示出神經(jīng)保護作用。然而,抑制小膠質(zhì)細胞向M1極化,促使其向M2型極化對顱腦創(chuàng)傷的作用及機制仍無相關(guān)報道。在本研究中我們結(jié)合體內(nèi)、外實驗研究調(diào)控小膠質(zhì)細胞向M2亞型極化對神經(jīng)炎癥反應(yīng)、軸索損傷以及顱腦創(chuàng)傷神經(jīng)功能預(yù)后的影響,為開發(fā)顱腦創(chuàng)傷治療的潛在新方法提供新思路。本研究分為三個部分:第一部分:小鼠原代小膠質(zhì)細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定;第二部分:體外實驗研究PPAR-γ激動劑調(diào)控小膠質(zhì)細胞向M2型極化對LPS刺激后神經(jīng)炎癥反應(yīng)的影響;第三部分:動物實驗研究研究PPAR-γ激動劑調(diào)控小膠質(zhì)細胞向M2型極化對顱腦創(chuàng)傷預(yù)后的影響。第一部分 小鼠原代小膠質(zhì)細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定目的:利用新生小鼠分離、培養(yǎng)小鼠原代小膠質(zhì)細胞,評估原代小膠質(zhì)細胞的純度,為進一步開展體外實驗研究調(diào)控小膠質(zhì)細胞極化亞型對炎癥反應(yīng)的影響奠定基礎(chǔ)。方法:利用新生的C57BL/6小鼠(1-2d),無菌條件下斷頭、取腦,顯微鏡下分離大腦皮層。切碎、消化、離心、重懸,將細胞接種于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中,原代混合膠質(zhì)細胞培養(yǎng)至第9天,細胞出現(xiàn)明顯分層生長,待細胞完全分層2天后進行搖床震搖分離,然后利用Iba-1免疫熒光檢測。結(jié)果:在倒置相差顯微鏡下可觀察到混和膠質(zhì)細胞長滿瓶底,并出現(xiàn)明顯的細胞分層現(xiàn)象,底層為扁平、多種形狀的、具有多個突起的星型膠質(zhì)細胞,上層細胞呈偏小、類圓形、折光性強,附著于星型膠質(zhì)細胞表面生長,為小膠質(zhì)細胞。靜息狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞表現(xiàn)為胞體較小,具有分支狀突起,而激活狀態(tài)的小膠質(zhì)呈現(xiàn)圓形或橢圓形。Iba-1免疫熒光鑒定小膠質(zhì)細胞純度92.58%。結(jié)論:原代分離、培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞純度較高,可用于進一步開展體外實驗研究小膠質(zhì)細胞極化亞型調(diào)控對神經(jīng)炎癥反應(yīng)的影響。第二部分 體外實驗研究PPAR-γ受體介導(dǎo)小膠質(zhì)細胞向M2亞型極化對神經(jīng)炎癥反應(yīng)的影響目的:通過體外實驗研究調(diào)控小膠質(zhì)細胞向M2型極化對LPS刺激后小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)的影響。方法:構(gòu)建小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)體系,并將其分為以下實驗組:小膠質(zhì)細胞組,小膠質(zhì)細胞+LPS組,小膠質(zhì)細胞+LPS+羅格列酮(PPAR-丫激動劑)組,小膠質(zhì)細胞+LPS+GW9662(PPAR-y拮抗劑)組。利用 ELISA 檢測炎癥因子 TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表達水平,PCR檢測小膠質(zhì)細胞極化標(biāo)志物M1型(CD16/32,CD86),M2型(CD206,Ym-1)表達水平以鑒定小膠質(zhì)極化亞型改變。結(jié)果:相比于對照小膠質(zhì)細胞,LPS刺激后小膠質(zhì)細胞M1亞型標(biāo)志物表達水平升高,M2亞型標(biāo)志物表達下降,炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表達顯著升高。相比于LPS刺激組,羅格列酮處理組小膠質(zhì)細胞M1型標(biāo)志物表達水平降低,M2型標(biāo)志物表達升高,同時炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表達水平顯著降低,GW9662處理組小膠質(zhì)細胞M1型標(biāo)志物表達升高,M2型標(biāo)志物表達下降,同時炎癥因子表達水平升高。結(jié)論:LPS處理后小膠質(zhì)細胞向M1亞型極化增強,伴隨炎癥因子表達上調(diào),利用羅格列酮調(diào)控小膠質(zhì)細胞向M2型極化可以降低LPS刺激后小膠質(zhì)細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表達,減輕炎癥反應(yīng)。第三部分 動物實驗研究PPAR-γ受體介導(dǎo)小膠質(zhì)細胞向M2亞型極化對顱腦創(chuàng)傷預(yù)后的影響目的:通過動物實驗研究調(diào)控小膠質(zhì)細胞向M2亞型極化對顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)炎癥反應(yīng)、軸索損傷以及神經(jīng)功能預(yù)后的影響。方法:利用C57BL/6小鼠構(gòu)建液壓損傷的顱腦創(chuàng)傷模型,并將小鼠分為以下實驗組:假手術(shù)組,顱腦創(chuàng)傷組,顱腦創(chuàng)傷+羅格列酮(PPAR-γ激動劑),顱腦創(chuàng)傷+GW9662組(PPAR-γ拮抗劑)。利用NSS評分評估小鼠TBI后的神經(jīng)功能預(yù)后,ELISA檢測小鼠腦皮層中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表達水平,鍍銀染色以及β-APP免疫組化檢測小鼠皮層中軸索損傷情況,qRT-PCR檢測小膠質(zhì)細胞極化標(biāo)志物M1型(CD16/32,CD86),M2型(CD206,Ym-1)表達水平,免疫熒光檢測小膠質(zhì)細胞極化表型。結(jié)果:相比假手術(shù)組小鼠,顱腦創(chuàng)傷后小鼠腦組織中小膠質(zhì)細胞M1亞型標(biāo)志物表達水平升高,M2亞型標(biāo)志物表達下降,炎癥因子TNF-αα、IL-1β、IL-6和IL-10表達顯著升高,軸索損傷指標(biāo)β-APP顯著升高。相比于TBI組小鼠,羅格列酮處理組的小鼠小膠質(zhì)細胞M1型標(biāo)志物表達水平降低,M2型標(biāo)志物表達升高,同時炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表達水平顯著降低,軸索損傷指標(biāo)β-APP顯著降低,NSS評分降低。相比于TBI組小鼠,GW9662處理組小鼠小膠質(zhì)細胞M1型標(biāo)志物表達水平升高,M2型標(biāo)志物表達降低,同時炎癥因子表達水平上升,軸索損傷指標(biāo)β-APP也顯著升高,NSS評分升高。結(jié)論:顱腦創(chuàng)傷后小膠質(zhì)細胞向M1型極化增強,伴有炎癥因子表達上調(diào)。利用羅格列酮(PPAR-γ激動劑)調(diào)控小膠質(zhì)細胞向M2型極化可以減輕顱腦創(chuàng)傷后腦皮層中炎癥反應(yīng),減輕軸索損傷情況,改善神經(jīng)功能預(yù)后。
【學(xué)位單位】:浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】:博士
【學(xué)位年份】:2019
【中圖分類】:R651.15
【部分圖文】:

小膠質(zhì)細胞,免疫熒光,紅色熒光,藍色


4.2原代小膠質(zhì)細胞Iba-1免疫熒光鑒定逡逑小膠質(zhì)細胞特異性抗體丨ba-1免疫熒光鑒定結(jié)果顯示,絕大部分分離培養(yǎng)的細逡逑胞Iba-1表徶陽性,陽性率平均為92.58%,表明小膠質(zhì)細胞分離成功。圖1.1是逡逑小膠質(zhì)細胞Iba-1免疫熒光鑒定結(jié)果,紅色熒光為Iba-1陽性細胞,藍色為DAPI逡逑核染色陽性。逡逑圖1.1小膠質(zhì)細胞Iba-1免疫熒光鑒定:紅色熒光為Iba-1陽性細胞,藍色為DAPI逡逑核染色陽性。逡逑9逡逑

表達水平,小膠質(zhì)細胞,蛋白,條帶


本研究中我們通過激活或抑制PPAR-y受體調(diào)控小膠質(zhì)細胞的極化亞型改變,逡逑實驗中利用Western-blot檢測PPAR-丫蛋白表達水平以反映各組細胞處理后PPAR-y逡逑受體激活情況。圖2.1分別是各組細胞中PPAR-Y表達條帶(A)和各組細胞中逡逑PPAR-y蛋白相對表達水平(B)。研究結(jié)果顯示,相比對照組小鼠,LPS刺激后小逡逑膠質(zhì)細胞中PPAR-y表徶水平顯著降低(p<0.01)。相比LPS處理組,LPS邋+PPAR-Y逡逑激動劑羅格列酮處理組小膠質(zhì)細胞中PPAR-y蛋白表達水平顯著升高(p<0.01),逡逑LPS邋+邋PPAR-y抑制劑GW9662處理組小膠質(zhì)細胞中PPAR-y蛋白表達水平降低(p<逡逑0.01)。結(jié)果表明,LPS刺激可以抑制小膠質(zhì)細胞中PPAR-y蛋白表達,羅格列酮和逡逑GW9662可以有效的上調(diào)或抑制小膠質(zhì)細胞中PPAR-y表達。逡逑A邋c,5l逡逑o邐**邐姦I邋Control逡逑l,c邐**邐 ̄邐■邐-?邋LPS逡逑2*邐1.0-邐■■邋LPS+Rosiglitazoir?逡逑^邋^邐IH|邐LPS+GW9662逡逑Pill邋ill逡逑y邐?逡逑/邋/逡逑B邋/邋^邋/邋/逡逑PPARy邋-mmmmmrn-邋,栥邐rnmmmmm邐栜逡逑圖2.1邋Westem-blot檢測各組細胞中PPAR-Y蛋白表徸情況逡逑圖2.1分別是各組細胞中PPAR-y蛋白檢測條帶(A)和相對表達水平(B)。結(jié)果逡逑顯示

表達水平,小膠質(zhì)細胞,亞型


研究中我們通過檢測小膠質(zhì)細胞表面標(biāo)志物的mRNA水平來判定小膠質(zhì)細胞逡逑極化亞型。CD16、CD86為Ml亞型小肢質(zhì)細胞標(biāo)志分子,CD206、YM-1為M2逡逑亞型小肢質(zhì)細胞標(biāo)志分子。圖2.2-圖2.5分別是各組小膠質(zhì)細胞中CD16、CD86、逡逑CD206和YM-lmRNA相對表達水平。結(jié)果顯示,相比于對照組細胞,LPS刺激逡逑后小膠質(zhì)細胞中CD16、CD86mRNA相對表徸水平均顯著升高(p<0.01),邋CD206逡逑和YM-lmRNA相對表達水平均顯著降低(p<0.01)。相比于LPS刺激組,LPS邋+逡逑PPAR-y激動劑羅格列酮組小膠質(zhì)細胞中CD16、CD86mRNA相對表達水平均顯著逡逑降低(p<邋0.01,p邋<0.05),CD206和YM-lmRNA相對表達水平均顯著升高(p<逡逑0.05)。相比于LPS組,LPS邋+邋PPAR-y拮抗劑GW9662組小膠質(zhì)細胞中CD16、CD86逡逑mRNA相對表達水顯著升高(p<邋0.05),CD206和YM-lmRNA相對表達水平顯逡逑著降低(p<0.05)。該研究結(jié)果表明,LPS損傷刺激可促使小膠質(zhì)細胞向Ml亞型逡逑極化

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本文編號:2820026


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