研究目的:創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury,TBI)不是單一的病理、生理過程,主要包括原發(fā)性和繼發(fā)性損傷過程,共同導致了神經(jīng)結(jié)構(gòu)的破壞和功能的受損。繼發(fā)性神經(jīng)炎癥反應(yīng)是TBI后重要的繼發(fā)性病理生理反應(yīng),在繼發(fā)性腦損傷中發(fā)揮了重要作用。小膠質(zhì)細胞作為中樞神經(jīng)最重要的固有免疫細胞和主要的效應(yīng)細胞,在TBI后繼發(fā)性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。更好的理解小膠質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)變的調(diào)節(jié)機制可以提高我們對TBI后神經(jīng)損傷及修復的認識,并為TBI的新治療策略的開發(fā)提供機會。但小膠質(zhì)細胞激活、分化的分子調(diào)控機制極為復雜,具體機制尚不清楚。細胞微粒(Microparticles,MPs)是一類介于0.1到1?μm大小的小細胞囊泡,它們含有多種生物活性分子,包括蛋白質(zhì)、生物脂類和核酸,穿梭于細胞間發(fā)揮遞質(zhì)作用,是導致機體產(chǎn)生相關(guān)炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)。由于腦組織細胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)較體內(nèi)其它細胞更高,因此腦組織來源的MPs(Brain-derived Microparticles,BDMPs)的促炎活性可能比血細胞源性的MPs要更高。然而BDMPs的分子生物學特點尚不十分清楚,未見其在TBI后的繼發(fā)性炎癥反應(yīng)中作用的相關(guān)研究報道。因此,本課題借助小鼠腦皮層下注射模型及體外小膠質(zhì)細胞,觀察BDMPs對小膠質(zhì)細胞激活的影響及相關(guān)炎性反應(yīng),探索BDMPs通過介導小膠質(zhì)細胞在TBI后繼發(fā)性炎癥反應(yīng)中的作用及其機制。研究方法(1)建立小鼠液壓打擊腦外傷(TBI)模型,使用酶消化梯度離心法從TBI后腦損傷區(qū)提取BDMPs,應(yīng)用應(yīng)用流式細胞術(shù)對TBI后腦損傷區(qū)BDMPs進行表型鑒定以及成分分析;(2)借助小鼠大腦皮層下注射模型,免疫熒光染色觀察小鼠腦注射區(qū)的小膠質(zhì)細胞激活情況,采用免疫組化染色觀察其激活,增殖以及分化(M1/M2)情況,應(yīng)用RT-PCR法檢測組織中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-l0及單核細胞趨化因子-1(MCP-1)的RNA含量;(3)將BDMPs與小膠質(zhì)細胞(BV2)中共培養(yǎng),應(yīng)用離子電導顯微鏡動態(tài)觀察小膠質(zhì)細胞的激活和形變情況,應(yīng)用western-blot和ELISA技術(shù)檢測小膠質(zhì)細胞中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-l0及單核細胞趨化因子(MCP-1/CCL-2)的含量變化。(4)借助小鼠大腦皮層下注射模型,通過伊文思藍注射觀察血腦屏障破壞情況,干濕重法對比腦水腫程度。體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)模擬腦血管屏障,加入BDMPs干預,觀察HUVEC屏障的通透性變化。研究結(jié)果(1)BDMPs表達數(shù)量不等的生物標記物(NSE和GFAP),進一步發(fā)現(xiàn)BDMPs是由多細胞源性MPs構(gòu)成,以神經(jīng)元性及膠質(zhì)細胞源性MPs為主,還含有血細胞及內(nèi)皮細胞來源MPs;(2)小鼠腦皮層下注射區(qū)的小膠質(zhì)細胞被BDMPs廣泛激活,形態(tài)由分支樣向球形轉(zhuǎn)化,并出現(xiàn)M1/M2表型的動態(tài)分化。PCR結(jié)果顯示腦組織中炎癥因子IL-1β,TNF-a,IL-6,單核細胞趨化因子CCL2和NOS2的mRNA增多;(3)體外實驗中小膠質(zhì)細胞與BDMPs共培養(yǎng)52分鐘后開始發(fā)生形變,104分鐘后完全激活形變。3小時后,小膠質(zhì)細胞結(jié)合并吞噬BDMPs,細胞裂解液中IL-6,TNF-α和MCP-1水平顯著升高,上清液ELISA實驗提示TNF-α和MCP-1水平增高,但IL-10水平均無顯著變化;(4)BDMPs注射后小鼠腦組織表面可見明顯水腫,依文思藍滲漏現(xiàn)象也比較嚴重。體外加入BDMPs懸液時,HUVEC屏障對FITC-Dextran的滲漏顯著增加;研究結(jié)論(1)BDMPs可以結(jié)合并介導小膠質(zhì)細胞的激活、形變以及分化,促進TNF-α、IL-1β、IL-6等多種炎性因子以及單核細胞趨化因子MCP-1/CCL-2高表達,在TBI后的繼發(fā)性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮促炎作用。(2)BDMPs可以增加BBB的通透性,加重腦水腫。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R651.15
【部分圖文】：

天津醫(yī)科大學博士學位論文13圖1.1 流式細胞儀鑒定BDMPs A: 根據(jù)Megamix標準微粒確定MPs的位置；B:圈選直徑＜0.9 μm的P1區(qū)域，即為MPs；C：以APC-Annexin V+EDTA和NSE/GFAP的IgG為對照，圈選Q2-5二者雙陽性區(qū)域，即為BDMP（sAnnexin V+ NSE/GFAP）。1.2.2 BDMPs中的各種細胞MPs含量分析選取P2區(qū)域的BDMPs進一步鑒別各種細胞來源MPs的含量，進入上述各種熒光標記的峰狀圖（與各自-IgG為同型對照）：神經(jīng)細胞來源MPs：（FITC-NSE）陽性率為43.2±11.4％（圖1.2A）膠質(zhì)細胞來源MPs：（FITC-GFAP）陽性率為36

熒光標記的峰狀圖（與各自-IgG為同型對照）：神經(jīng)細胞來源MPs：（FITC-NSE）陽性率為43.2±11.4％（圖1.2A）膠質(zhì)細胞來源MPs：（FITC-GFAP）陽性率為36.8±10.3％（圖1.2B）血小板來源MPs：（FITC-CD42b）陽性率為3.1±0.9％（圖1.2C）白細胞來源MPs：（PE-Cy7-CD45）陽性率為2.3±0.9％（圖1.2D）內(nèi)皮細胞來源MPs：（Fluor 450-CD144）陽性率為1.5±0.3％（圖1.2E）紅細胞來源MPs：（APC-CD235）陽性率為3.8±0.8％（圖1.2F）

天津醫(yī)科大學博士學位論文比較采用SNK法。統(tǒng)計分析采用SPSS 18.0，P＜0.05有統(tǒng)計學差異。2 結(jié)果.1 小鼠皮層下注射模型的建立將提前制備好的 BDMPs 與上清液 1:1 稀釋制成 BDMPs 懸液，大約06BDMPs/10ul，通過立體定向裝置，利用 10ul 微量注射器，將 10ulBD注入到小鼠的皮層下接近基底節(jié)位置，前期對 BDMPs 懸液的濃度和注行了預實驗，發(fā)現(xiàn) 10ul，1:1 稀釋濃度的 BDMPs 懸液既能在小鼠皮層明顯的損傷區(qū)域，并且建模過程中小鼠也有較高的生存率。為了排除小膠質(zhì)細胞和炎性反應(yīng)的影響，設(shè)置 10ul 上清液皮層下注射對照組以組。相對于研究 TBI 模型中 BDMPs 的作用機制，單獨皮層下注射 BD有助于規(guī)避 TBI 后腦損傷區(qū)復雜的干擾因素的影響。如圖 2.1

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