【摘要】：急性缺血性腦卒中能夠引發(fā)大腦神經組織的一系列應激反應,包括酸中毒、興奮性氨基酸釋放、細胞內鈣超載、氧自由基釋放、炎癥反應及細胞凋亡,這些應激反應的進展通常反應腦卒中的病理進程。準確評價腦缺血后某一時期應激反應進展,實現其定位、定性、定量及可視化,對于評估腦損傷與修復、指導腦卒中的個體化治療和預測病人預后具有重要的意義。分子影像技術能夠通過特異性的分子探針從活細胞水平實現特定分子的可視化和定量研究,可用于腦缺血后病理進程的監(jiān)測。但現有的可用于腦卒中分子成像的特異性分子探針報道并不多見,限制了分子影像技術的應用。本研究通過噬菌體展示肽庫體內篩選技術,以期獲得能夠靶向缺血腦組織的多肽,并構建分子探針,初步實現缺血腦卒中的分子成像,主要實驗結果如下：1、急性缺血腦組織靶向分子的體內篩選通過線栓法構建小鼠右側大腦中動脈阻塞(MCAO)模型,模擬人類急性缺血性腦卒中。通過噬菌體展示七肽庫對MCAO小鼠進行體內篩選,經四輪篩選后噬菌體克隆在MCAO小鼠缺血側腦組織的密度較第一輪篩選時富集了10.4倍。從第四輪篩選所回收噬菌體克隆中隨機挑選120個分隔良好的藍色噬菌斑進行擴增培養(yǎng)后,提取DNA測序,最終成功測序106個噬菌體克隆,共得到17種序列,其中多肽序列HGGVRLY出現頻次最高,占有絕對優(yōu)勢,將其命名為HGG肽,展示有該肽的噬菌體克隆命名為HGG-M13噬菌體,作為候選噬菌體用于后續(xù)實驗。2、HGG-M13噬菌體肽及HGG肽靶向缺血腦組織的特異性鑒定本研究首先從HGG-M13噬菌體的角度,通過噬菌體體內回輸實驗和免疫熒光實驗鑒定HGG-M13噬菌體能夠靶向缺血腦組織,而且這種靶向性依賴于噬菌體表面展示的HGG肽而不是噬菌體自身的骨架蛋白；免疫熒光雙標實驗結果提示HGG-M13噬菌體與缺血腦組織中部分神經元共定位。隨后,分別采用5-TAMRA和FITC兩種熒光基團修飾HGG肽,并注射至MCAO小鼠體內,HGG熒光肽主要集中在缺血側腦組織,與HGG-M13噬菌體結果相一致,再次提示HGG肽能夠靶向缺血腦組織。此外,通過體外培養(yǎng)神經元,構建氧糖剝奪模型,并用HGG熒光肽與之孵育,結果提示HGG熒光肽能夠與氧糖剝奪后的神經元結合。3、基于HGG肽構建急性腦缺血靶向分子探針及初步分子成像在EDC/Sulfa-NHS活化下,HGG肽上的氨基與錳鋅鐵氧體納米顆粒表面所攜帶的羧基發(fā)生縮合反應,使得錳鋅鐵氧體納米顆粒表面修飾HGG肽,從而構建得到分子探針,并對其表征：電鏡尺寸大小為15.17 nm,水合粒徑為53.98 nm,r2弛豫率為382.45mM-1S-1。將該分子探針注射至MCAO小鼠體內,通過磁共振成像檢測到該分子探針的信號主要聚集在大腦缺血側,而未經HGG肽修飾的錳鋅鐵氧體對照探針則無信號。綜上所述,本研究通過噬菌體展示肽庫篩選技術對MCAO小鼠進行體內篩選,得到能夠靶向缺血腦組織的HGG肽,并初步鑒定了該肽的靶細胞為缺血狀態(tài)下的神經元。基于該肽構建了磁共振成像分子探針,磁共振成像顯示該分子探針能夠在MCAO小鼠的缺血側腦組織內分布,但是否可用于腦卒中的分子成像需要進一步深入研究。
【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R743.3

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本文編號：2806384