【摘要】：目的:急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是一種以肺實質(zhì)彌漫性炎癥和頑固性低氧血癥為特征的臨床危重癥。革蘭陰性細菌感染作為ARDS發(fā)生的重要原因之一,其主要的致病成分脂多糖(LPS)可誘導顯著的氧化應激和炎癥反應,此二者被認為在ARDS發(fā)病機理中居于重要地位并且具有彼此促進、相輔相成的特點。因此,靶向氧化應激和炎癥應答的治療手段,可能為ARDS的臨床防治提供新的思路。近年來,中藥單體尤其是黃酮類化合物即因其優(yōu)良的抗氧化和抗炎活性而備受關注。異甘草素作為一種來源于甘草根的黃酮類化合物,同樣具有抗氧化、抗炎等多重藥理活性。然而目前關于異甘草素在LPS誘導的ARDS中是否具有保護作用及其機制尚有待進一步研究。方法:本實驗擬構建體外和體內(nèi)兩種模型,研究異甘草素在RAW 264.7細胞和ARDS模型中的保護作用及其機制。體外實驗中,我們在RAW 264.7細胞中分別以叔丁基過氧化氫(t-BHP)誘導氧化應激觀察其體外抗氧化活性和機制;以LPS誘導炎癥反應觀察其體外抗炎活性和機制,并進一步研究了其抗氧化機制與抗炎機制間的相互關系,在此過程中主要應用MTT法、酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)、免疫印跡法(Western Blot)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染等分子生物學方法。體內(nèi)實驗中,我們以LPS構建小鼠ARDS的模型,在體外實驗基礎上進一步研究異甘草素對LPS誘導小鼠ARDS模型中氧化和炎癥性損傷的保護作用和分子機制,并且在此基礎上選用基因敲除小鼠深入探究其抗氧化機制與抗炎機制間的相互關系,在此過程中主要應用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)、免疫印跡法(Western Blot)、流式細胞術(FCM)等分子生物學方法。結果:1.在體外,異甘草素具有良好的抗氧化和抗炎活性,表現(xiàn)在其對t-BHP誘導的細胞毒性、ROS產(chǎn)生和LPS誘導的iNOS、COX-2產(chǎn)生以及細胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)分泌的顯著抑制。異甘草素上調(diào)AMPK/Nrf2通路并可能由此介導了其抗氧化活性,同時它還通過對NF-κB通路和NLRP3炎癥小體激活的抑制作用發(fā)揮抗炎活性,且對后者的抑制效應至少部分與Nrf2活化有關。2.在體內(nèi),異甘草素顯著改善小鼠ARDS模型中LPS誘導的肺組織病理改變,減輕小鼠肺水腫程度,并且能夠抑制BALF中ROS產(chǎn)生、炎癥細胞(巨噬細胞、中性粒細胞)滲出和細胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)分泌,降低肺組織中MPO、MDA產(chǎn)生,GSH、SOD消耗,以及iNOS、COX-2表達。這種作用可能與其上調(diào)肺組織中AMPK/Nrf2/ARE通路和抑制LPS誘導的NF-κB通路活化和NLRP3炎癥小體激活密切相關。3.相比于野生型小鼠,Nrf2~(-/-)小鼠中ARDS模型中異甘草素減輕LPS誘導的肺組織病理改變、腹腔巨噬細胞ROS產(chǎn)生以及抑制小鼠肺組織NLRP3炎癥小體激活的作用明顯減弱,而對NF-κB通路的抑制作用未受明顯影響,表明了異甘草素在LPS誘導小鼠ARDS模型中的抗氧化、抗炎活性及保護作用至少部分通過Nrf2介導。結論:綜上所述,異甘草素通過上調(diào)AMPK/Nrf2/ARE通路、抑制NF-κB通路活化(Nrf2非依賴性)和NLRP3炎癥小體激活(Nrf2依賴性)發(fā)揮抗氧化和抗炎活性,在LPS誘導的小鼠ARDS模型中起到保護作用。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R563.8
【圖文】：

17圖1.1 異甘草素的化學結構1.2.2.1 抗炎作用大量實驗證據(jù)表明，異甘草素在體內(nèi)外均具有良好的抗炎活性。異甘草素可以在受體水平抑制 LPS 誘導的 TLR4 二聚化，導致 NF-κB 和干擾素調(diào)節(jié)因子3 活化的抑制，以及多種炎性介質(zhì)的抑制。在細胞水平，異甘草素通過抑制 IκBα 降解和 NF-κB 核轉(zhuǎn)位，減輕 TNF-α 活化的人臍靜脈內(nèi)皮細胞中血管內(nèi)皮細胞黏附分子（VCAM）-1和 E-選擇素的 mRNA聚集，下調(diào)細胞黏附分子蛋白水平，從而干擾了 THP 單核細胞對內(nèi)皮細胞的黏附；在骨髓來源的樹突狀細胞中，它能明顯抑制 LPS 誘導的 IL-6、IL-12 p40 的增加，它也能夠通過抑制 NF-κB p65 和活化蛋白-1（AP-1） 活化減輕 LPS誘導的巨噬細胞的炎癥應答

29圖2.1 異甘草素顯著抑制RAW 264.7細胞中t-BHP誘導的細胞毒性RAW 264.7 細胞經(jīng)不同濃度異甘草素預處理 18 h 后，給予 t-BHP 刺激 3 h，MTT 法測定細胞存活率。注，采用 mean ± SEM 表示結果，n = 3（獨立重復試驗次數(shù)），與空白組相比，*P < 0.05 和**P < 0.01；與 t-BHP 組相比，#P < 0.05和##P < 0.01。2.3.2 異甘草素顯著抑制 t-BHP 誘導的 ROS 產(chǎn)生t-BHP刺激引起的ROS異常產(chǎn)生是氧化應激的重要誘因及標志物，也是引起細胞損傷甚至死亡的主要原因。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)

30圖2.2 異甘草素顯著抑制RAW 264.7細胞中t-BHP誘導的ROS產(chǎn)生RAW 264.7細胞經(jīng)不同濃度異甘草素預處理18 h后加入DCFH-DA（終濃度5μM）染色40 min，給予t-BHP刺激5 min。（A）應用酶標儀測定ROS水平。（B）顯微鏡下觀察綠色熒光（放大倍數(shù)100倍）測定ROS水平。圖中：(a)空白， (b)異甘草素(20 μM)， (c) t-BHP (10 mM)，(d) t-BHP +異甘草素(5 μM)，(e)t-BHP +異甘草素(10 μM)， (f) t-BHP +異甘草素(20 μM)。注，采用mean ± SEM表示結果

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本文編號：2783263