【摘要】：目的:急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是一種以肺實(shí)質(zhì)彌漫性炎癥和頑固性低氧血癥為特征的臨床危重癥。革蘭陰性細(xì)菌感染作為ARDS發(fā)生的重要原因之一,其主要的致病成分脂多糖(LPS)可誘導(dǎo)顯著的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),此二者被認(rèn)為在ARDS發(fā)病機(jī)理中居于重要地位并且具有彼此促進(jìn)、相輔相成的特點(diǎn)。因此,靶向氧化應(yīng)激和炎癥應(yīng)答的治療手段,可能為ARDS的臨床防治提供新的思路。近年來(lái),中藥單體尤其是黃酮類(lèi)化合物即因其優(yōu)良的抗氧化和抗炎活性而備受關(guān)注。異甘草素作為一種來(lái)源于甘草根的黃酮類(lèi)化合物,同樣具有抗氧化、抗炎等多重藥理活性。然而目前關(guān)于異甘草素在LPS誘導(dǎo)的ARDS中是否具有保護(hù)作用及其機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。方法:本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建體外和體內(nèi)兩種模型,研究異甘草素在RAW 264.7細(xì)胞和ARDS模型中的保護(hù)作用及其機(jī)制。體外實(shí)驗(yàn)中,我們?cè)赗AW 264.7細(xì)胞中分別以叔丁基過(guò)氧化氫(t-BHP)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激觀察其體外抗氧化活性和機(jī)制;以L(fǎng)PS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)觀察其體外抗炎活性和機(jī)制,并進(jìn)一步研究了其抗氧化機(jī)制與抗炎機(jī)制間的相互關(guān)系,在此過(guò)程中主要應(yīng)用MTT法、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、免疫印跡法(Western Blot)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染等分子生物學(xué)方法。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,我們以L(fǎng)PS構(gòu)建小鼠ARDS的模型,在體外實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究異甘草素對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠ARDS模型中氧化和炎癥性損傷的保護(hù)作用和分子機(jī)制,并且在此基礎(chǔ)上選用基因敲除小鼠深入探究其抗氧化機(jī)制與抗炎機(jī)制間的相互關(guān)系,在此過(guò)程中主要應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、免疫印跡法(Western Blot)、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)等分子生物學(xué)方法。結(jié)果:1.在體外,異甘草素具有良好的抗氧化和抗炎活性,表現(xiàn)在其對(duì)t-BHP誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性、ROS產(chǎn)生和LPS誘導(dǎo)的iNOS、COX-2產(chǎn)生以及細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)分泌的顯著抑制。異甘草素上調(diào)AMPK/Nrf2通路并可能由此介導(dǎo)了其抗氧化活性,同時(shí)它還通過(guò)對(duì)NF-κB通路和NLRP3炎癥小體激活的抑制作用發(fā)揮抗炎活性,且對(duì)后者的抑制效應(yīng)至少部分與Nrf2活化有關(guān)。2.在體內(nèi),異甘草素顯著改善小鼠ARDS模型中LPS誘導(dǎo)的肺組織病理改變,減輕小鼠肺水腫程度,并且能夠抑制BALF中ROS產(chǎn)生、炎癥細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞)滲出和細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)分泌,降低肺組織中MPO、MDA產(chǎn)生,GSH、SOD消耗,以及iNOS、COX-2表達(dá)。這種作用可能與其上調(diào)肺組織中AMPK/Nrf2/ARE通路和抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB通路活化和NLRP3炎癥小體激活密切相關(guān)。3.相比于野生型小鼠,Nrf2~(-/-)小鼠中ARDS模型中異甘草素減輕LPS誘導(dǎo)的肺組織病理改變、腹腔巨噬細(xì)胞ROS產(chǎn)生以及抑制小鼠肺組織NLRP3炎癥小體激活的作用明顯減弱,而對(duì)NF-κB通路的抑制作用未受明顯影響,表明了異甘草素在LPS誘導(dǎo)小鼠ARDS模型中的抗氧化、抗炎活性及保護(hù)作用至少部分通過(guò)Nrf2介導(dǎo)。結(jié)論:綜上所述,異甘草素通過(guò)上調(diào)AMPK/Nrf2/ARE通路、抑制NF-κB通路活化(Nrf2非依賴(lài)性)和NLRP3炎癥小體激活(Nrf2依賴(lài)性)發(fā)揮抗氧化和抗炎活性,在LPS誘導(dǎo)的小鼠ARDS模型中起到保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R563.8
【圖文】：

17圖1.1 異甘草素的化學(xué)結(jié)構(gòu)1.2.2.1 抗炎作用大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，異甘草素在體內(nèi)外均具有良好的抗炎活性。異甘草素可以在受體水平抑制 LPS 誘導(dǎo)的 TLR4 二聚化，導(dǎo)致 NF-κB 和干擾素調(diào)節(jié)因子3 活化的抑制，以及多種炎性介質(zhì)的抑制。在細(xì)胞水平，異甘草素通過(guò)抑制 IκBα 降解和 NF-κB 核轉(zhuǎn)位，減輕 TNF-α 活化的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（VCAM）-1和 E-選擇素的 mRNA聚集，下調(diào)細(xì)胞黏附分子蛋白水平，從而干擾了 THP 單核細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附；在骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞中，它能明顯抑制 LPS 誘導(dǎo)的 IL-6、IL-12 p40 的增加，它也能夠通過(guò)抑制 NF-κB p65 和活化蛋白-1（AP-1） 活化減輕 LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的炎癥應(yīng)答

29圖2.1 異甘草素顯著抑制RAW 264.7細(xì)胞中t-BHP誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性RAW 264.7 細(xì)胞經(jīng)不同濃度異甘草素預(yù)處理 18 h 后，給予 t-BHP 刺激 3 h，MTT 法測(cè)定細(xì)胞存活率。注，采用 mean ± SEM 表示結(jié)果，n = 3（獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)次數(shù)），與空白組相比，*P < 0.05 和**P < 0.01；與 t-BHP 組相比，#P < 0.05和##P < 0.01。2.3.2 異甘草素顯著抑制 t-BHP 誘導(dǎo)的 ROS 產(chǎn)生t-BHP刺激引起的ROS異常產(chǎn)生是氧化應(yīng)激的重要誘因及標(biāo)志物，也是引起細(xì)胞損傷甚至死亡的主要原因。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)

30圖2.2 異甘草素顯著抑制RAW 264.7細(xì)胞中t-BHP誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生RAW 264.7細(xì)胞經(jīng)不同濃度異甘草素預(yù)處理18 h后加入DCFH-DA（終濃度5μM）染色40 min，給予t-BHP刺激5 min。（A）應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定ROS水平。（B）顯微鏡下觀察綠色熒光（放大倍數(shù)100倍）測(cè)定ROS水平。圖中：(a)空白， (b)異甘草素(20 μM)， (c) t-BHP (10 mM)，(d) t-BHP +異甘草素(5 μM)，(e)t-BHP +異甘草素(10 μM)， (f) t-BHP +異甘草素(20 μM)。注，采用mean ± SEM表示結(jié)果

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本文編號(hào)：2783263