【摘要】：研究背景:非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoho lic fatty liver disease,NAFLD)目前已成為全球主要的慢性肝病和公共衛(wèi)生問題,但人們對NAFLD的發(fā)病機制仍知之甚少,學(xué)界主流認(rèn)為的“二次打擊”假說并不足以解釋這種異質(zhì)性疾病的發(fā)病機制。目前發(fā)現(xiàn)腸道微生態(tài)是被遺忘的一大人體新陳代謝器官,它具有維持能量穩(wěn)態(tài)等重要的生理學(xué)作用。迄今為止腸道微生態(tài)在NAFLD和非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis,NASH)發(fā)生發(fā)展中的作用正被人們逐漸揭示。然而,NAFLD發(fā)展至NASH的過程中,腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)及功能的動態(tài)改變至今仍缺乏相關(guān)研究。丁酸是短鏈脂肪酸的重要成員,目前已發(fā)現(xiàn)丁酸具有抗炎、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、促進細(xì)胞凋亡、促進免疫穩(wěn)態(tài)、改善腸道屏障的作用。然而,丁酸是否可以通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的結(jié)構(gòu)及功能發(fā)揮對NASH的保護作用仍未可知。因此針對以上背景,本文計劃研究NASH進展過程中腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)及功能的動態(tài)變化及丁酸的保護作用。研究方法:本研究分兩部分,第一部分通過構(gòu)建蛋氨酸-膽堿缺乏(Methionine-choline-deficient,MCD)飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠模型,動態(tài)監(jiān)測小鼠從單純脂肪變性(飼喂2周)至NASH(飼喂4周)過程中腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)及功能的變化,構(gòu)建微生物組及代謝組的聯(lián)合分析模式。本部分共設(shè)四組,Control 2w組、MCD 2w組、Control 4w組、MCD 4w組。第二部分在構(gòu)建NASH小鼠模型的基礎(chǔ)上,每日予丁酸鈉(Sodium butyrate,SoB)灌胃處理共6周,研究丁酸對NASH的保護作用,以及對NASH小鼠腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)及功能的重塑作用,本部分共設(shè)四組,Control 組、MCD 組、Control+SoB 組、MCD+SoB 組。研究結(jié)果:第一部分:1.MCD飲食飼喂小鼠2周后出現(xiàn)單純脂肪變性,4周后出現(xiàn)NASH。單純脂肪變性進展到NASH的過程中,丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase,AST),肝內(nèi)甘油三酯(Triglycerides,TG)含量,NAFLD 活動度評分(NAFLD activity score,NAS)均升高,巨噬細(xì)胞浸潤程度不斷增強,ZO-1免疫熒光染色提示腸屏障破壞程度不斷增加。NASH小鼠伴隨出現(xiàn)肝纖維化。2.單純脂肪變性小鼠腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)改變不明顯,但進展至NASH后開始出現(xiàn)腸道菌群紊亂。機會致病菌:嗜膽菌屬(Bilophila)、厭氧菌屬(Anaerotruncus)、梭菌屬(Clostridium)、螺旋桿菌科(Helicobacteraceae)的豐度在NASH中顯著提高。而益生菌薩特氏菌屬(Sutterella)、阿克曼菌屬(Akkermansia)豐度在NASH中顯著降低。3.腸道菌群代謝功能在NASH進展中持續(xù)改變。四個實驗組在主成分分析(Principal component analysis,PCA)及有監(jiān)督的正交偏最小二乘法分析(Orthogonal partial least-squares-discriminant analysis,OPLS-DA)中均能明顯區(qū)分�；ㄉ嵩谡＝M穩(wěn)定存在,二十四烷酸在NASH進展中持續(xù)存在。最終分別在MCD飲食飼喂2周和4周后鑒定出103種和93種差異代謝物,其中大部分涉及與脂質(zhì)、氨基酸、碳水化合物、核苷酸、輔因子和維生素代謝相關(guān)的通路。第二部分:1.丁酸可改善肝臟損傷、炎癥及脂質(zhì)代謝。肝臟HE染色顯示,丁酸可降低MCD飲食誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變性及炎癥,降低NAS評分,改善肝功能(ALT、AST),降低甘油三酯含量,調(diào)控炎癥及脂質(zhì)代謝相關(guān)因子的mRNA表達量。2.丁酸可延緩肝纖維化進展并調(diào)節(jié)Toll樣受體表達。丁酸干預(yù)后肝纖維化指標(biāo):TGF-β1、α-SMA表達量降低,MASSON染色及α-SMA免疫組化染色結(jié)果證實肝纖維化得到改善。TLR4、CD14 mRNA表達量降低。3.丁酸改善了血清細(xì)胞因子并降低內(nèi)毒素水平。丁酸干預(yù)不僅顯著下調(diào)了促炎細(xì)胞因子(IL-1α,IL-1β,IL-2,IL-3,IL-6,IL-12p70,IL-17a,TNF-α,Eotaxin)的水平,也顯著上調(diào)了抗炎細(xì)胞因子IL-4和IL-10的水平。丁酸干預(yù)組血清內(nèi)毒素結(jié)合蛋白(Lipopolysaccharide binding protein,LBP)水平較 MCD 組小鼠顯著降低。4.丁酸可穩(wěn)定結(jié)腸屏障功能。腸道屏障指標(biāo)ZO-1,claudin-1 mRNA表達量在丁酸干預(yù)組上調(diào)。ZO-1免疫熒光染色證實該組腸屏障功能得到改善。5.丁酸重塑了 MCD飲食誘導(dǎo)的腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂。主坐標(biāo)分析(Principal coordinates analysis,PCoA)結(jié)果顯示,四個實驗組的微生態(tài)結(jié)構(gòu)可以良好區(qū)分,線性判別分析效應(yīng)大小((Linear discriminant analysis effect size,LEfSe)分析顯示丁酸可重塑腸道菌群結(jié)構(gòu),顯著提高一些益生菌如阿克曼菌(Akkermansia)、羅氏菌屬(Roseburia)的豐度。6.丁酸改善了 MCD飲食誘導(dǎo)的腸道微生態(tài)功能紊亂。OPLS-DA模型顯示MCD組和MCD+SoB組可明顯區(qū)分。兩組間最終篩選出98種差異代謝物,飽和脂肪酸(如硬脂酸和二十二烷酸),不飽和脂肪酸(如油酸和亞油酸)和角鯊烯(一種天然的30碳三萜)的含量在MCD+SoB組小鼠的糞便中顯著增加,花生四烯酸(一種不飽和脂肪酸)的含量在該組顯著降低。7.丁酸重塑的腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)及功能在改善NASH中具有重要作用。在NASH中豐度顯著升高的嗜膽菌屬(Bilophila)、理研菌科(Rikenellaceae)與ALT、IL-17α、LBP、TLR2、TLR4、TNF-α水平正相關(guān);丁酸干預(yù)后豐度顯著升高的益生菌阿克曼菌屬(Akkermansia)與 ALT、NAS、TG、F4/80、IL-12 p70、IL-17α、IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、TLR2、TLR4、LBP負(fù)相關(guān);丁酸干預(yù)后豐度升高的代謝物角鯊烯、硬脂酸可能與改善肝臟損傷有關(guān),它們均與ALT、IL-1β、IL-17α、LBP、F4/80 負(fù)相關(guān)。結(jié)論:1.MCD飲食誘導(dǎo)了腸道菌群結(jié)構(gòu)及功能的實質(zhì)改變。對這些改變的基礎(chǔ)了解將為NASH及其相關(guān)的腸道功能紊亂的腸道靶向治療提供新的依據(jù)。本部分研究為第二部分丁酸干預(yù)研究提供了模型及技術(shù)基礎(chǔ)。2.丁酸可誘導(dǎo)腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)及功能的保護性改變,從而有效地預(yù)防MCD飲食誘導(dǎo)的與NASH相關(guān)的肝臟和腸道損傷�？诜∷徕c可能是比較有前景的NASH治療策略。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R575.3
【圖文】：

３．２邋ＭＣＤ飲食喂食４周后小鼠出現(xiàn)肝纖維化逡逑Ｍａｓｓｏｎ染色和ａ－ＳＭＡ免疫組織化學(xué)染色并未發(fā)現(xiàn)ＭＣＤ飲食喂食小鼠２周后，逡逑出現(xiàn)肝纖維化的證據(jù)（圖３．２）。根據(jù)Ｍａｓｓｏｎ染色計算的肝纖維化指數(shù)（％）定量逡逑結(jié)果顯示Ｃｏｎｔｒｏｌ邋２ｗ組為２．１７邋±０．３０％，邋ＭＣＤ２ｗ組為．２．６９邋±０．２６％，兩組比較無逡逑２１逡逑

Ｃｏｎｉｒｏｌ邋２ｗ邋ＭＣＤ邋２ｗ邋Ｃｏｎｔｒｏｌ邋４ｗ邋ＭＣＤ邋４ｗ邐Ｃｏｎｔｒｏｌ邋２ｗ邋ＭＣＤ邋２ｗ邋Ｃｏｎｔｒｏｌ邋４＼ｖ邋ＭＣＤ邋４ｖｖ逡逑圖３．１邋ＭＣＤ飲食誘導(dǎo)的肝損傷，脂肪堆積和巨噬細(xì)胞浸潤。Ａ－Ｃ：通過ＨＥ染色逡逑（Ａ），油紅０染色（Ｂ）和巨噬細(xì)胞（Ｆ４／８０）染色（Ｃ）評估肝臟組織病理學(xué)改逡逑變。比例尺：２５０邋ｐｍ。Ｄ：由平均光密度表示的油紅Ｏ染色強度。Ｅ：通過Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ逡逑Ｐｌｕｓ軟件對Ｆ４／８０陽性細(xì)胞進行計數(shù)的百分比。數(shù)據(jù)以平均值±ＳＥＭ表示。每組小逡逑鼠只數(shù)邋ｎ邋＝邋６。＊＊Ｐ邋＜０．０１；＊＊＊邋Ｐ＜０．００１。逡逑３．２邋ＭＣＤ飲食喂食４周后小鼠出現(xiàn)肝纖維化逡逑Ｍａｓｓｏｎ染色和ａ－ＳＭＡ免疫組織化學(xué)染色并未發(fā)現(xiàn)ＭＣＤ飲食喂食小鼠２周后，逡逑出現(xiàn)肝纖維化的證據(jù)（圖３．２）。根據(jù)Ｍａｓｓｏｎ染色計算的肝纖維化指數(shù)（％）定量逡逑結(jié)果顯示Ｃｏｎｔｒｏｌ邋２ｗ組為２．１７邋±０．３０％，邋ＭＣＤ２ｗ組為．２．６９邋±０．２６％，兩組比較無逡逑２１逡逑

Ｃｏｎｔｒｏｌ邋２ｗ組小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞表面的ＺＯ－１蛋白光滑連續(xù)致密，無中斷無破壞，逡逑而ＭＣＤ邋２ｗ姐小鼠的結(jié)腸組織頂面和隱窩部位表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)破壞和紊亂，中間有幾逡逑處缺失，ＺＯ－１蛋白表達水平降低（圖３．３）。同Ｃｏｎｔｒｏｌ邋２ｗ組，Ｃｏｎｔｒｏｌ邋４ｗ組小鼠逡逑結(jié)腸上皮細(xì)胞表面的ＺＯ－１蛋白連續(xù)表達，結(jié)構(gòu)完整無中斷。而喂食ＭＣＤ飲食４逡逑周的小鼠腸屏障功能進一步受損，表現(xiàn)為更加嚴(yán)重的蛋白缺失和大片段斷層，蛋逡逑白覆蓋厚度較Ｃｏｎｔｒｏｌ４ｗ組明顯降低（圖３．３）。逡逑２３逡逑

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