【摘要】：第一部分原核表達并純化血栓調(diào)節(jié)蛋白N端結(jié)構(gòu)域和HMGB1 目的：原核表達并純化純度較高的血栓調(diào)節(jié)蛋白N端結(jié)構(gòu)域和HMGB1,獲得相應(yīng)蛋白。 方法：取正常小鼠肝組織提取總RNA作為模板,根據(jù)目的基因的要求,設(shè)計兩對引物,經(jīng)RT-PCR轉(zhuǎn)錄出血栓調(diào)節(jié)蛋白N端結(jié)構(gòu)域和HMGB1基因片段并擴增；兩種基因片段與PMD-18T克隆載體的連接,構(gòu)建克隆載體PMD-18T-TM-N和PMD-18T-HMGB1,經(jīng)專業(yè)生物公司測序確定后；分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli DH5a,大量克隆并提取,雙酶切后,分別與同樣雙酶切之后的表達載體PET-28a連接,得到帶6-His標(biāo)簽的表達載體PET-28a-TM-N和PET-28a-HMGB1,測序正確；分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21,分別用不同濃度異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(ITPG)誘導(dǎo),Ni2+-NTA樹脂層析柱純化得到目的蛋白(TM-N為包涵體,逐步透析降低尿素濃度,使之自動折疊復(fù)性)。 結(jié)果：得到TM-N與HMGB1基因的原核表達質(zhì)粒PET-28a-TM-N和PET-28a-HMGB1,雙酶切、PCR、測序得知各基因均正確的插入到原核質(zhì)粒中；誘導(dǎo)純化分離得到的蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測證明為TM-N與HMGB1蛋白。 結(jié)論：成功得到PET-28a-TM-N與PET-28a-HMGB1,并得到重組TM-N與HMGB1蛋白。 第二部分重組蛋白在小鼠肝衰竭模型中的作用 目的：研究HMGB1對小鼠肝臟的損傷作用及作用通路；研究血栓調(diào)節(jié)蛋白N端結(jié)構(gòu)域在小鼠肝衰竭模型中的作用。 方法： 1. C57BL普通小鼠隨機分為3組,以下藥物均腹腔注射：對照組：D-Galn600mg/kg、LPS5μg/kg;實驗組：HMGB1150μg/kg;空白組：等量生理鹽水。分別于2、6、12、24h經(jīng)眼眶取血,取血后頸椎脫臼處死,取肝組織固定12h,制成石蠟切片HE染色。免疫組織化測肝組織中HMGB1的表達、免疫熒光法檢測肝組織NF-κB、 RT-PCR測HMGB1-mRNA變化趨勢、ELISA測血清ALT、TNF-α,HMGB1配對t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)處理。 2.TLR4基因敲除小鼠按1.方法分組、注射藥物、取肝組織和血清及檢測。 3.構(gòu)建普通小鼠肝衰竭模型,腹腔注射重組TM-N,余按照1.方法進行。結(jié)果： 1.在普通小鼠中：腹腔注射D-Galn和LPS的對照組和腹腔注射HMGB1的實驗組均出現(xiàn)嚴重的肝組織壞死,免疫組化和RT-PCR可知肝組織內(nèi)均有HMGB1的大量表達,血清內(nèi)HMGB1也均明顯升高(24小時對照組為189.91±21.31ng/ml,實驗組為234.25±17.03ng/ml),遠高于空白組(1.99±0.85ng/ml)；血清內(nèi)ALT均明顯升高(12小時峰值對照組為144.27±20.37U/L,實驗組為127.42±11.05U/L),遠高于空白組(9.19±3.57U/L)。免疫熒光檢測NF-κB也顯示,對照組與實驗組均出現(xiàn)明顯表達。 2.在TLR4基因敲除小鼠中：腹腔注射D-Galn和LPS的對照組與注射鹽水的空白組一樣,肝組織完全正常,組化切片和RT-PCR可知肝組織內(nèi)僅細胞核內(nèi)少量表達HMGB1,細胞漿無HMGB1表達,血清內(nèi)ALT和HMGB1也無升高；注射HMGB1的實驗組出現(xiàn)嚴重的肝組織壞死,肝損傷作用但較普通小鼠實驗組肝損稍輕；組化切片和RT-PCR可知肝組織內(nèi)均有HMGB1的大量表達,血清內(nèi)HMGB1(對照組峰值為24小時194.63±12.74ng/ml)和ALT(對照組峰值為12小時157.36±23.79U/L)較空白組均明顯升高。 3.腹腔注射rTM-N,肝組織HE染色顯示實驗組肝損傷明顯減輕,免疫組化檢測HMGB1和TM均顯著少于對照組；免疫熒光檢測NF-κB顯著少于對照組。PCR檢測肝組織HMGB1-mRNA,實驗組各個時間點表達水平明顯低于對照組,12h峰值為98.44±13.69倍遠低于對照組的200.54±24.57倍(P0.05)見圖14；實驗組各個時間點TM-mRNA水平也明顯低于對照組,12h峰值為21.46±2.79倍遠低于對照組的58.63±5.78倍(P0.05)。實驗組血清中各時間點ALT、TNF-α和HMGB1的水平明顯低于對照組,實驗組ALT、TNF-α和HMGB1峰值分別為68.33±10.29(24小時)、355.42±53.55(12小時)和64.38±4.92(24小時),顯著低于對照組,分別為127.42±11.05(12小時)、634.23±35.18(6小時)和234.25±17.03(24小時),P0.05。 結(jié)論：1.HMGB1和LPS一樣,也可以激活NF-κB及其下游通路,導(dǎo)致普通小鼠肝臟嚴重的損傷； 2.LPS不能導(dǎo)致TLR4基因敲除小鼠的肝損傷,提示LPS主要通過TLR4受體發(fā)揮; 3.TLR4受體的敲除,對于HMGB1的致炎作用影響并不大,因此HMGB1同樣能導(dǎo)致TLR4基因敲除小鼠嚴重的肝損,推測HMGB1的致炎作用通路可能主要為RAGE受體。 4. rTM-N能夠減少HMGB1?TM和NF-kB的分泌,減少肝衰竭中血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量,改善肝功能,減小肝組織損傷,降低血管內(nèi)皮損傷程度。 第三部分重組TM-N蛋白在體外的抗炎作用 目的：觀察重組TM-N蛋白在體外的抗炎作用。 方法：用LPS或rHMGB1刺激小鼠肝竇內(nèi)皮細胞,加入不同濃度血栓調(diào)節(jié)蛋白N, CCK8法檢測不同時間點細胞活力；免疫熒光檢測細胞內(nèi)HMGB1、TM和NF-κB; ELISA法細胞上清中TNF-α的含量；RT-PCR檢測HMGB1-mRNA或TM-mRNA相對空白組變化趨勢。 結(jié)果：CCK8實驗表明：LPS的刺激下,2小時各組細胞活力幾乎是一致,各組無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),隨著時間的推移,實驗組各時間點細胞活力始終均大于對照組,rTM-N濃度為100ng/ml時能夠使細胞活力持續(xù)維持在90%以上,48h時實驗組細胞活力為92.825%±2.42%,對照組為65.24%±3.79%(P0.05),rTM-N濃度越大細胞活力有所減少,但均大于80%；在rHMGB1的刺激下,實驗組細胞活力始終大于對照組,rTM-N濃度越大活力越大,rTM-N濃度為1ug/ml時能夠使細胞活力維持在85%以上,48h細胞活力實驗組為84.33%±3.69%,對照組為51.635%±2.55%,細胞活力明顯提高,有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05) 免疫熒光實驗中,在LPS刺激下,鏡下觀和IOD值都提示,實驗組細胞中NF-kB, HMGB1或TM較對照組分布減少,顆粒熒光減弱。RT-PCR顯示實驗組細胞HMGB1-mRNA或TM-mRNA表達減少。 結(jié)論：因此rTM-N可以減輕LPS或HMGB1對細胞的毒性作用、增強細胞活性。LPS能夠刺激小鼠肝竇內(nèi)皮細胞產(chǎn)生大量的HMGB1,加入rTM-N蛋白能夠減少LSEC分泌HMGB1、TM及NF-KB,減輕內(nèi)皮細胞的損傷程度。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R575.3

【共引文獻】

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本文編號：2769665