【摘要】：背景與目的:急性肺損傷(ALI)為膿毒癥的常見并發(fā)癥,發(fā)病率和死亡率居高不下。肺泡巨噬細(xì)胞(AM)在ALI的防御和修復(fù)中起著重要的作用。在不同微環(huán)境刺激下,巨噬細(xì)胞可發(fā)生M1和M2極化,但AM的極化及對(duì)ALI的影響尚不明確。GTS-21為膽堿能抗炎通路(CAP)選擇性α 7煙堿型乙酰膽堿受體激動(dòng)劑(α7nAChR),在ALI的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。然而,GTS-21介導(dǎo)的抑制炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制仍有部分不清楚。高遷移率族蛋白-1(HMGB1)可激活黑素瘤缺乏因子2(AIM2)炎癥小體復(fù)合物引起促炎反應(yīng),且兩者在ALI中均具有重要的作用。然而HMGB1與AIM2之間的相互作用機(jī)制尚不清楚。巨噬細(xì)胞可表達(dá)AIM2炎癥小體復(fù)合物和HMGB1的主要受體:晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)、Toll樣受體2、4(TLR 2、TLR4)來傳遞細(xì)胞內(nèi)信號(hào)。研究目的:1.探索GTS-21通過調(diào)節(jié)AM的極化功能來參與脂多糖(LPS)所致ALI的抗炎機(jī)制;2.探索HMGB1通過調(diào)節(jié)AM的極化功能來參與LPS所致ALI的炎癥反應(yīng)機(jī)制。方法:第一部分:從C57BL/6小鼠肺泡灌洗液(BALF)中提取AM,刺激后極化為M1型AM和M2型AM。再將M1和M2型AM分別注入去除AM的小鼠氣道,然后建立LPS所致ALI模型,觀察M1和M2型AM對(duì)LPS所致ALI小鼠肺損傷評(píng)分、肺水腫程度和肺部炎癥因子的影響。第二部分:建立LPS所致ALI小鼠模型,分為空白對(duì)照組、LPS組、GTS-21組和GTS-21+LPS組。體外培養(yǎng)AM,在有無LPS和有無GTS-21的刺激下,分為同樣四組。通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)觀察GTS-21對(duì)LPS所致ALI中AM的數(shù)量、AM的極化以及對(duì)HMGB1分泌的影響。第三部分:應(yīng)用anti-HMGB1或rHMGB1干預(yù)LPS所致ALI小鼠,測(cè)定干預(yù)措施對(duì)肺組織炎癥損傷、AIM2炎癥小體復(fù)合物的蛋白以及mRNA表達(dá)。通過流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)M1型AM表面相關(guān)因子(MHCⅡ、CD80、CD86、CD40)和M2型AM表面相關(guān)因子(CD206、IL-10)的表達(dá)水平。體外培養(yǎng)骨髓來源的巨噬細(xì)胞,觀察Anti-HMGB1或rHMGB1刺激后AIM2炎癥小體復(fù)合物的蛋白以及mRNA表達(dá)以及M1和M2型AM表面相關(guān)因子的表達(dá)。第四部分:為了驗(yàn)證HMGB1對(duì)巨噬細(xì)胞的作用通路,應(yīng)用anti-HMGB1或rHMGB1作用于LPS所致ALI小鼠,觀察TLR2/4、RAGE受體和NF-κB表達(dá)水平的變化;應(yīng)用TLR2/4和RAGE受體拮抗劑作用于LPS所致ALI小鼠,觀察肺部炎癥和AIM2炎癥小體復(fù)合物的變化。在體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中加入以上干預(yù)措施,觀察AIM2炎癥小體復(fù)合物的變化。結(jié)果:(1)M1型AM可加重LPS所致ALI的促炎反應(yīng)。主要表現(xiàn)為:肺MPO活性增強(qiáng),肺W/D上升,BALF中(TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1)的水平明顯增高。M2型AM可減輕LPS所致ALI小鼠的炎癥反應(yīng),主要表現(xiàn)為肺損傷評(píng)分降低,肺MPO活性和肺W/D減低,BALF中MCP-1的水平降低。(2)在LPS所致ALI小鼠中,GTS-21可減輕肺組織炎癥,減少AM的數(shù)量及炎癥因子的表達(dá),降低肺組織、血漿以及BALF中HMGB1的分泌和表達(dá)。GTS-21可降低LPS所致ALI小鼠和體外培養(yǎng)的AM中M1型AM生物活性分子iNOS和促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-12)的水平,增加M2型AM生物活性分子 Arg1、Ym1 和抗炎因子(CCL17、CCL22、CCL24)的水平。(3)抗HMGB 1抗體可減輕LPS所致ALI小鼠肺組織炎癥,抑制AIM2炎癥小體復(fù)合物的活性,抑制AM向M1極化;rHMGB1可增加LPS所致ALI小鼠肺組織炎癥,增強(qiáng)AIM2炎癥小體復(fù)合物的活性,促進(jìn)AM向M1極化。(4)抗HMGB 1抗體可下調(diào)LPS所致ALI中TLR 2、TLR 4和RAGE/NF-κB的表達(dá);rHMGB 1可上調(diào)上述受體的表達(dá);(TLR2、TLR4受體拮抗劑)LPS-RS和(RAGE受體拮抗劑)FPS-ZM1能抑制LPS所致ALI肺部炎癥,降低AIM 2炎癥小體復(fù)合物的表達(dá)。結(jié)論:(1)M1型AM可加重LPS所致ALI肺組織炎癥;M2型AM可減輕LPS所致ALI肺組織炎癥。(2)膽堿能抗炎通路可通過減少AM的數(shù)量,抑制M1型AM的極化,抑制AM內(nèi)HMGB 1的分泌來減輕LPS所致ALI。(3)HMGB1可通過激活A(yù)IM2炎癥小體復(fù)合物和促進(jìn)AM的M1極化來參與LPS所致ALI的炎癥反應(yīng)過程。(4)在LPS所致ALI中,HMGB1激活A(yù)IM2炎癥小體復(fù)合物和促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M1極化的作用可能是通過TLR2、TLR4、RAGE和NF-κB通路來實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R563.8
【圖文】：

－１邋Ｍｌ型ＡＭ加重ＡＬＩ小鼠肺組織炎癥浸潤。（ａ）肺組織切片的ＨＥ染色（＞＜４００）和（ｂ）分結(jié)果。Ａ為對(duì)照組，Ｂ為ＬＰＳ誘導(dǎo)的急性肺損傷組（ＬＰＳ），邋Ｃ為ＡＭ去除的肺損Ｓ＋ＣＬ）、Ｄ為ＡＭ去除的肺損傷＋Ｍ１－ＡＭ過繼轉(zhuǎn)移組（ＬＰＳ＋ＣＬ＋Ｍｌ），邋Ｅ為ＡＭ去除＋Ｍ２－ＡＭ過繼轉(zhuǎn)移組（ＬＰＳ＋ＣＬ＋Ｍ２）。圖中箭頭所指為肺泡腔內(nèi)肺泡巨噬細(xì)胞（ＡＭ）。據(jù)應(yīng)用均ex土標(biāo)準(zhǔn)誤表示（每組４－６只小鼠）。＊Ｐ＜０．０５．＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊叩＜０．００１。逡逑邋Ｍｌ、Ｍ２型ＡＭ對(duì)ＬＰＳ所致ＡＬＩ小鼠肺Ｗ／Ｄ和ＭＰ性的影響逡逑Ｗ／Ｄ結(jié)果反應(yīng)肺水腫程度，Ｍ．ＰＯ活性為中性粒細(xì)胞功能和聚集程度指標(biāo)，間接反映了肺組織的炎癥浸潤程度。通過測(cè)定各組中這兩個(gè)指標(biāo)變步反映Ｍｌ型ＡＭ或Ｍ２型ＡＭ對(duì)ＡＬＩ小鼠肺部炎癥反應(yīng)的影響。結(jié)ｌ－２ａ、ｂ所示，當(dāng)ＬＰＳ組與對(duì)照組相比時(shí)Ｗ／Ｄ和ＭＰＯ值均明顯增高；ＡＭＡＬＩ小鼠肺組織勻漿內(nèi)所測(cè)得ＭＰＯ值明顯升高，但Ｗ／Ｄ未發(fā)現(xiàn)明顯差Ｓ＋ＣＬ＋Ｍ１組與ＬＰＳ＋ＣＬ組和ＬＰＳ＋ＣＬ＋Ｍ２組相比較時(shí)Ｗ／Ｄ和ＭＰＯ值均

Ａｔ？＝邐＿邐－邐－逡逑圖１－１邋Ｍｌ型ＡＭ加重ＡＬＩ小鼠肺組織炎癥浸潤。（ａ）肺組織切片的ＨＥ染色（＞＜４００）和（ｂ）肺損逡逑傷評(píng)分結(jié)果。Ａ為對(duì)照組，Ｂ為ＬＰＳ誘導(dǎo)的急性肺損傷組（ＬＰＳ），邋Ｃ為ＡＭ去除的肺損傷組逡逑（ＬＰＳ＋ＣＬ）、Ｄ為ＡＭ去除的肺損傷＋Ｍ１－ＡＭ過繼轉(zhuǎn)移組（ＬＰＳ＋ＣＬ＋Ｍｌ），邋Ｅ為ＡＭ去除的肺逡逑損傷＋Ｍ２－ＡＭ過繼轉(zhuǎn)移組（ＬＰＳ＋ＣＬ＋Ｍ２）。圖中箭頭所指為肺泡腔內(nèi)肺泡巨噬細(xì)胞（ＡＭ）。所逡逑有數(shù)據(jù)應(yīng)用均ex土標(biāo)準(zhǔn)誤表示（每組４－６只小鼠）。＊Ｐ＜０．０５．＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊叩＜０．００１。逡逑３．２邋Ｍｌ、Ｍ２型ＡＭ對(duì)ＬＰＳ所致ＡＬＩ小鼠肺Ｗ／Ｄ和ＭＰＯ逡逑活性的影響逡逑Ｗ／Ｄ結(jié)果反應(yīng)肺水腫程度，Ｍ．ＰＯ活性為中性粒細(xì)胞功能和聚集程度的重逡逑要指標(biāo)，間接反映了肺組織的炎癥浸潤程度。通過測(cè)定各組中這兩個(gè)指標(biāo)變化可逡逑進(jìn)一步反映Ｍｌ型ＡＭ或Ｍ２型ＡＭ對(duì)ＡＬＩ小鼠肺部炎癥反應(yīng)的影響。結(jié)果如逡逑圖ｌ－２ａ、ｂ所示，當(dāng)ＬＰＳ組與對(duì)照組相比時(shí)Ｗ／Ｄ和ＭＰＯ值均明顯增高；ＡＭ去逡逑除后ＡＬＩ小鼠肺組織勻漿內(nèi)所測(cè)得ＭＰＯ值明顯升高，但Ｗ／Ｄ未發(fā)現(xiàn)明顯差異；逡逑ＬＰＳ＋ＣＬ＋Ｍ１組與ＬＰＳ＋ＣＬ組和ＬＰＳ＋ＣＬ＋Ｍ２組相比較時(shí)Ｗ／Ｄ和ＭＰＯ值均明顯逡逑增高；而ＬＰＳ＋ＣＬ＋Ｍ２組與ＬＰＳ＋ＣＬ組相比較時(shí)Ｗ／Ｄ和ＭＰＯ值均明顯降低。逡逑以上結(jié)果說明：ＡＭ參與調(diào)節(jié)ＡＬＩ小鼠肺水腫和中性粒細(xì)胞浸潤的調(diào)節(jié)

通過對(duì)分離出的ＡＭ進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，篩選出ＣＤＩ１Ｔ４／８０－的細(xì)胞，即為逡逑ＡＭ。然后通過分析ＧＴＳ－２１干預(yù)后，ＡＭ數(shù)目的變化觀察ＧＴＳ－２１是否對(duì)ＡＭ的逡逑數(shù)量有影響。如圖２－２邋（ａ、ｂ）所示，ＬＰＳ組中ＡＭ的數(shù)量較對(duì)照組明顯增高，而逡逑經(jīng)過ＧＴＳ－２１后，ＡＭ數(shù)量較未干預(yù)組明顯下降。也就是說，ＧＴＳ－２１可減少ＬＰＳ逡逑小鼠ＡＭ的數(shù)量。通過染色，測(cè)定ＡＭ表面主要表達(dá)的炎癥因子：其中ＩＬ－６和逡逑ＩＬ－１２ｐ４０為促炎因子，ＩＬ－１０為抗炎因子的比例。圖２－２邋（ｃ、ｄ）所示，ＬＰＳ＋ＧＴＳ－２１逡逑３９逡逑

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