【摘要】：背景與目的:急性肺損傷(ALI)為膿毒癥的常見并發(fā)癥,發(fā)病率和死亡率居高不下。肺泡巨噬細胞(AM)在ALI的防御和修復中起著重要的作用。在不同微環(huán)境刺激下,巨噬細胞可發(fā)生M1和M2極化,但AM的極化及對ALI的影響尚不明確。GTS-21為膽堿能抗炎通路(CAP)選擇性α 7煙堿型乙酰膽堿受體激動劑(α7nAChR),在ALI的治療中具有廣闊的應用前景。然而,GTS-21介導的抑制炎癥反應的分子機制仍有部分不清楚。高遷移率族蛋白-1(HMGB1)可激活黑素瘤缺乏因子2(AIM2)炎癥小體復合物引起促炎反應,且兩者在ALI中均具有重要的作用。然而HMGB1與AIM2之間的相互作用機制尚不清楚。巨噬細胞可表達AIM2炎癥小體復合物和HMGB1的主要受體:晚期糖基化終產物受體(RAGE)、Toll樣受體2、4(TLR 2、TLR4)來傳遞細胞內信號。研究目的:1.探索GTS-21通過調節(jié)AM的極化功能來參與脂多糖(LPS)所致ALI的抗炎機制;2.探索HMGB1通過調節(jié)AM的極化功能來參與LPS所致ALI的炎癥反應機制。方法:第一部分:從C57BL/6小鼠肺泡灌洗液(BALF)中提取AM,刺激后極化為M1型AM和M2型AM。再將M1和M2型AM分別注入去除AM的小鼠氣道,然后建立LPS所致ALI模型,觀察M1和M2型AM對LPS所致ALI小鼠肺損傷評分、肺水腫程度和肺部炎癥因子的影響。第二部分:建立LPS所致ALI小鼠模型,分為空白對照組、LPS組、GTS-21組和GTS-21+LPS組。體外培養(yǎng)AM,在有無LPS和有無GTS-21的刺激下,分為同樣四組。通過體內和體外實驗觀察GTS-21對LPS所致ALI中AM的數量、AM的極化以及對HMGB1分泌的影響。第三部分:應用anti-HMGB1或rHMGB1干預LPS所致ALI小鼠,測定干預措施對肺組織炎癥損傷、AIM2炎癥小體復合物的蛋白以及mRNA表達。通過流式細胞學檢測M1型AM表面相關因子(MHCⅡ、CD80、CD86、CD40)和M2型AM表面相關因子(CD206、IL-10)的表達水平。體外培養(yǎng)骨髓來源的巨噬細胞,觀察Anti-HMGB1或rHMGB1刺激后AIM2炎癥小體復合物的蛋白以及mRNA表達以及M1和M2型AM表面相關因子的表達。第四部分:為了驗證HMGB1對巨噬細胞的作用通路,應用anti-HMGB1或rHMGB1作用于LPS所致ALI小鼠,觀察TLR2/4、RAGE受體和NF-κB表達水平的變化;應用TLR2/4和RAGE受體拮抗劑作用于LPS所致ALI小鼠,觀察肺部炎癥和AIM2炎癥小體復合物的變化。在體外培養(yǎng)的巨噬細胞中加入以上干預措施,觀察AIM2炎癥小體復合物的變化。結果:(1)M1型AM可加重LPS所致ALI的促炎反應。主要表現(xiàn)為:肺MPO活性增強,肺W/D上升,BALF中(TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1)的水平明顯增高。M2型AM可減輕LPS所致ALI小鼠的炎癥反應,主要表現(xiàn)為肺損傷評分降低,肺MPO活性和肺W/D減低,BALF中MCP-1的水平降低。(2)在LPS所致ALI小鼠中,GTS-21可減輕肺組織炎癥,減少AM的數量及炎癥因子的表達,降低肺組織、血漿以及BALF中HMGB1的分泌和表達。GTS-21可降低LPS所致ALI小鼠和體外培養(yǎng)的AM中M1型AM生物活性分子iNOS和促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-12)的水平,增加M2型AM生物活性分子 Arg1、Ym1 和抗炎因子(CCL17、CCL22、CCL24)的水平。(3)抗HMGB 1抗體可減輕LPS所致ALI小鼠肺組織炎癥,抑制AIM2炎癥小體復合物的活性,抑制AM向M1極化;rHMGB1可增加LPS所致ALI小鼠肺組織炎癥,增強AIM2炎癥小體復合物的活性,促進AM向M1極化。(4)抗HMGB 1抗體可下調LPS所致ALI中TLR 2、TLR 4和RAGE/NF-κB的表達;rHMGB 1可上調上述受體的表達;(TLR2、TLR4受體拮抗劑)LPS-RS和(RAGE受體拮抗劑)FPS-ZM1能抑制LPS所致ALI肺部炎癥,降低AIM 2炎癥小體復合物的表達。結論:(1)M1型AM可加重LPS所致ALI肺組織炎癥;M2型AM可減輕LPS所致ALI肺組織炎癥。(2)膽堿能抗炎通路可通過減少AM的數量,抑制M1型AM的極化,抑制AM內HMGB 1的分泌來減輕LPS所致ALI。(3)HMGB1可通過激活AIM2炎癥小體復合物和促進AM的M1極化來參與LPS所致ALI的炎癥反應過程。(4)在LPS所致ALI中,HMGB1激活AIM2炎癥小體復合物和促進巨噬細胞的M1極化的作用可能是通過TLR2、TLR4、RAGE和NF-κB通路來實現(xiàn)的。
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R563.8
【圖文】：

－１邋Ｍｌ型ＡＭ加重ＡＬＩ小鼠肺組織炎癥浸潤。（ａ）肺組織切片的ＨＥ染色（＞＜４００）和（ｂ）分結果。Ａ為對照組，Ｂ為ＬＰＳ誘導的急性肺損傷組（ＬＰＳ），邋Ｃ為ＡＭ去除的肺損Ｓ＋ＣＬ）、Ｄ為ＡＭ去除的肺損傷＋Ｍ１－ＡＭ過繼轉移組（ＬＰＳ＋ＣＬ＋Ｍｌ），邋Ｅ為ＡＭ去除＋Ｍ２－ＡＭ過繼轉移組（ＬＰＳ＋ＣＬ＋Ｍ２）。圖中箭頭所指為肺泡腔內肺泡巨噬細胞（ＡＭ）。據應用均ex土標準誤表示（每組４－６只小鼠）。＊Ｐ＜０．０５．＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊叩＜０．００１。逡逑邋Ｍｌ、Ｍ２型ＡＭ對ＬＰＳ所致ＡＬＩ小鼠肺Ｗ／Ｄ和ＭＰ性的影響逡逑Ｗ／Ｄ結果反應肺水腫程度，Ｍ．ＰＯ活性為中性粒細胞功能和聚集程度指標，間接反映了肺組織的炎癥浸潤程度。通過測定各組中這兩個指標變步反映Ｍｌ型ＡＭ或Ｍ２型ＡＭ對ＡＬＩ小鼠肺部炎癥反應的影響。結ｌ－２ａ、ｂ所示，當ＬＰＳ組與對照組相比時Ｗ／Ｄ和ＭＰＯ值均明顯增高；ＡＭＡＬＩ小鼠肺組織勻漿內所測得ＭＰＯ值明顯升高，但Ｗ／Ｄ未發(fā)現(xiàn)明顯差Ｓ＋ＣＬ＋Ｍ１組與ＬＰＳ＋ＣＬ組和ＬＰＳ＋ＣＬ＋Ｍ２組相比較時Ｗ／Ｄ和ＭＰＯ值均

Ａｔ？＝邐＿邐－邐－逡逑圖１－１邋Ｍｌ型ＡＭ加重ＡＬＩ小鼠肺組織炎癥浸潤。（ａ）肺組織切片的ＨＥ染色（＞＜４００）和（ｂ）肺損逡逑傷評分結果。Ａ為對照組，Ｂ為ＬＰＳ誘導的急性肺損傷組（ＬＰＳ），邋Ｃ為ＡＭ去除的肺損傷組逡逑（ＬＰＳ＋ＣＬ）、Ｄ為ＡＭ去除的肺損傷＋Ｍ１－ＡＭ過繼轉移組（ＬＰＳ＋ＣＬ＋Ｍｌ），邋Ｅ為ＡＭ去除的肺逡逑損傷＋Ｍ２－ＡＭ過繼轉移組（ＬＰＳ＋ＣＬ＋Ｍ２）。圖中箭頭所指為肺泡腔內肺泡巨噬細胞（ＡＭ）。所逡逑有數據應用均ex土標準誤表示（每組４－６只小鼠）。＊Ｐ＜０．０５．＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊叩＜０．００１。逡逑３．２邋Ｍｌ、Ｍ２型ＡＭ對ＬＰＳ所致ＡＬＩ小鼠肺Ｗ／Ｄ和ＭＰＯ逡逑活性的影響逡逑Ｗ／Ｄ結果反應肺水腫程度，Ｍ．ＰＯ活性為中性粒細胞功能和聚集程度的重逡逑要指標，間接反映了肺組織的炎癥浸潤程度。通過測定各組中這兩個指標變化可逡逑進一步反映Ｍｌ型ＡＭ或Ｍ２型ＡＭ對ＡＬＩ小鼠肺部炎癥反應的影響。結果如逡逑圖ｌ－２ａ、ｂ所示，當ＬＰＳ組與對照組相比時Ｗ／Ｄ和ＭＰＯ值均明顯增高；ＡＭ去逡逑除后ＡＬＩ小鼠肺組織勻漿內所測得ＭＰＯ值明顯升高，但Ｗ／Ｄ未發(fā)現(xiàn)明顯差異；逡逑ＬＰＳ＋ＣＬ＋Ｍ１組與ＬＰＳ＋ＣＬ組和ＬＰＳ＋ＣＬ＋Ｍ２組相比較時Ｗ／Ｄ和ＭＰＯ值均明顯逡逑增高；而ＬＰＳ＋ＣＬ＋Ｍ２組與ＬＰＳ＋ＣＬ組相比較時Ｗ／Ｄ和ＭＰＯ值均明顯降低。逡逑以上結果說明：ＡＭ參與調節(jié)ＡＬＩ小鼠肺水腫和中性粒細胞浸潤的調節(jié)

通過對分離出的ＡＭ進行流式細胞學檢測，篩選出ＣＤＩ１Ｔ４／８０－的細胞，即為逡逑ＡＭ。然后通過分析ＧＴＳ－２１干預后，ＡＭ數目的變化觀察ＧＴＳ－２１是否對ＡＭ的逡逑數量有影響。如圖２－２邋（ａ、ｂ）所示，ＬＰＳ組中ＡＭ的數量較對照組明顯增高，而逡逑經過ＧＴＳ－２１后，ＡＭ數量較未干預組明顯下降。也就是說，ＧＴＳ－２１可減少ＬＰＳ逡逑小鼠ＡＭ的數量。通過染色，測定ＡＭ表面主要表達的炎癥因子：其中ＩＬ－６和逡逑ＩＬ－１２ｐ４０為促炎因子，ＩＬ－１０為抗炎因子的比例。圖２－２邋（ｃ、ｄ）所示，ＬＰＳ＋ＧＴＳ－２１逡逑３９逡逑

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本文編號：2768539