【摘要】：腦水腫在我國是最常見的顱內(nèi)急癥,常見于腦缺血以及創(chuàng)傷性的腦損傷后。腦水腫治療的及時性對患者的神經(jīng)功能恢復(fù)至關(guān)重要,它也是腦損傷后高死亡率和高致殘率的主要原因。臨床上對于腦水腫的治療主要限于高滲療法,目前所使用的抗腦水腫藥物也存在一定的局限。由于腦水腫發(fā)生的詳細機制研究還不是很清楚,從而限制了新的抗腦水腫藥物的開發(fā)。細胞壞死是多種腦損傷后損傷區(qū)域與及其損傷區(qū)周圍的主要病理改變。程序性細胞壞死(necroptosis)是一種由細胞內(nèi)受體相互作用蛋白激酶(receptor interacting protein kinase 3,RIP3)/混合譜系結(jié)構(gòu)域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)信號介導的可控性的細胞壞死,是腦損傷及腦缺血后細胞死亡的主要方式之一。程序性細胞壞死是否參與腦損傷后腦水腫形成,至今未見研究。本項目采用顱腦開放性損傷模型、腦缺血模型,研究了腦損傷后程序性壞死關(guān)鍵分子RIP3、MLKL及腦水腫相關(guān)指標的表達;采用RIP3、MLKL基因敲除小鼠,研究了RIP3和MLKL在腦水腫發(fā)生中的作用,為闡明腦損傷后腦水腫的發(fā)生的機制提供了新的角度。目的揭示程序性細胞壞死關(guān)鍵分子MLKL和RIP3在小鼠損傷后腦水腫組織中的表達及作用,為腦損傷后腦水腫的機制研究和治療策略提供新的思路。材料與方法腦損傷模型的建立:通過向野生型(Wild type,WT)和MLKL敲除(MLKL~(-/-))、RIP3敲除(RIP3~(-/-))小鼠尾靜脈注射玫瑰紅溶液(藥量40 mg/kg、濃度6 mg/ml),構(gòu)建缺血性腦損傷致腦水腫模型。另使用創(chuàng)傷模型的撞擊裝置,在撞擊速度為2 m/s,深度為1.5 mm,持續(xù)時間為200 ms條件下沖擊小鼠皮質(zhì),構(gòu)建創(chuàng)傷性腦損傷后腦水腫模型。造模成功后,灌注取腦,制備冰凍切片,分別利用蘇木精伊紅染色(HE)技術(shù)及干濕重方法分析腦組織缺血及損傷后腦水腫情況;利用免疫熒光染色及免疫電鏡技術(shù)觀察程序性壞死/腦水腫關(guān)鍵基因MLKL/RIP3蛋白在腦水腫區(qū)域的表達和分布;利用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)(Western Blot)檢測小鼠腦水腫后MLKL/RIP3蛋白的表達情況及參與腦水腫調(diào)控的水通道蛋白-4(aquaporin,AQP4)的表達變化情況。結(jié)果1.腦損傷致腦水腫模型的建立:缺血后損傷后,HE染色顯示缺血損傷后腦中線偏移,損傷側(cè)腦組織有顯著的水腫現(xiàn)象;開放性顱腦創(chuàng)傷后,腦組織干濕重測量顯示創(chuàng)傷組腦組織水分含量顯著增多。2.腦水腫組織中程序性壞死關(guān)鍵分子RIP3、MLKL的表達:Western Blot顯示:腦缺血及創(chuàng)傷致腦水腫后,損傷側(cè)MLKL及RIP3蛋白表達分布增加;免疫熒光雙標染色顯示:正常小鼠皮質(zhì)無RIP3和MLKL表達,腦損傷后,MLKL及RIP3蛋白特異性分布于血管旁星形膠質(zhì)細胞;免疫電鏡研究顯示:在水腫區(qū),血管周圍星形膠質(zhì)細胞內(nèi)有大量標記MLKL及RIP3的膠體金顆粒分布。3.程序性壞死在損傷后腦水腫中的作用:免疫組化及Western Blot結(jié)果顯示,與野生型小鼠相比,RIP3、MLKL敲除小鼠損傷區(qū)AQP4表達增加,免疫球蛋白(IgG)滲出減少,水腫面積縮小,提示MLKL及RIP3可能參與調(diào)節(jié)腦水腫,可作為腦水腫治療的潛在靶標。結(jié)論腦損傷可上調(diào)MLKL及RIP3的表達。水腫期,血管周圍的星形膠質(zhì)細胞表達MLKL和RIP3,發(fā)生程序性壞死。,敲除MLKL和RIP3基因可減輕損傷導致的腦水腫,提示程序性細胞壞死相關(guān)蛋白可能參與了腦水腫發(fā)生。
【學位授予單位】：成都醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R651.15
【圖文】：

圖 1-1 腦缺血模型的建立顱腦損傷模型的建立（圖 1-2）2%巴比妥鈉將小鼠麻醉，待麻醉后縱向剪開頭皮，暴露顱 mm，腦中線左側(cè)旁約 0.5 cm 處開孔，用鑷子拋開露骨壞。裝置撞擊小鼠皮質(zhì)開孔處，所用裝置與平面垂直。沖擊持續(xù)時間為 200 ms，使小鼠腦皮質(zhì)出現(xiàn)中重度損傷。若止血處理，圓形鋼頭在沖擊的過程中，注意固定好小鼠用碘伏消毒損傷部位，將剪開頭皮縫合，關(guān)閉裝置。置保暖處至其蘇醒，72 h 后取組織。

圖 1-1 腦缺血模型的建立放性顱腦損傷模型的建立（圖 1-2）為2%巴比妥鈉將小鼠麻醉，待麻醉后縱向剪開頭皮，暴露顱骨，.5-2 mm，腦中線左側(cè)旁約 0.5 cm 處開孔，用鑷子拋開露骨，小破壞。模裝置撞擊小鼠皮質(zhì)開孔處，所用裝置與平面垂直。沖擊速度m，持續(xù)時間為 200 ms，使小鼠腦皮質(zhì)出現(xiàn)中重度損傷。若撞擊予止血處理，圓形鋼頭在沖擊的過程中，注意固定好小鼠頭部，用碘伏消毒損傷部位，將剪開頭皮縫合，關(guān)閉裝置。放置保暖處至其蘇醒，72 h 后取組織。

成都醫(yī)學院碩士學位論文腦損傷模型的建立 腦缺血模型的建立及腦水腫的測量按照文獻制備小鼠腦缺血模型[18, 19]。造模前，將假手術(shù)組和腦缺血組在統(tǒng)一環(huán)一周，然后通過尾靜脈注射玫瑰紅溶液制造缺血后腦水腫模型，造模結(jié)束后 7取組織，冰凍切片后進行 HE 染色。HE 染色結(jié)果顯示，缺血組皮質(zhì)區(qū)域有明顯及腦組織腫脹，導致半球中線偏移。以損傷側(cè)面積與正常腦組織側(cè)面積的比值腫指數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺血側(cè)腦組織面積與正常側(cè)腦組織面積的比值大于 1，提示缺腫脹(圖 1-3)。實驗結(jié)果

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本文編號：2749225