【摘要】：目的:基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)代謝組學(xué)技術(shù)篩選用于評估大鼠急性百草枯(PQ)中毒嚴(yán)重程度的血漿代謝物的生物標(biāo)志物,為急性百草枯中毒的早期診斷及病情嚴(yán)重程度提供依據(jù),同時探討急性百草枯的中毒機(jī)制。方法:24只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為生理鹽水對照組、低劑量中毒組(40mg/Kg)、中劑量中毒組(80mg/Kg)、高劑量中毒組(120mg/Kg),每組6只。于灌胃后觀察大鼠一般情況,在24h收集大鼠腹主動脈血,采用GC-MS方法檢測血漿中內(nèi)源性小分子代謝物,并進(jìn)行代謝輪廓及隨機(jī)森林分析,篩選潛在的生物標(biāo)志物;同時檢測大鼠肝腎功能。并采取HE染色觀察百草枯中毒大鼠肺損傷程度。結(jié)果:(1)觀察各組發(fā)現(xiàn),40mg/Kg中毒組大鼠灌胃后表現(xiàn)出活動減少、食量減少等中毒癥狀,80mg/Kg中毒組大鼠癥狀較40mg/Kg組大鼠更重,并有呼吸急促,刺激后反應(yīng)遲鈍,120mg/Kg組反應(yīng)相當(dāng)遲鈍,刺激后仍蜷縮不動,基本無飲水進(jìn)食活動,還出現(xiàn)了呼吸費力、鼻部有泡沫樣液體溢出等癥狀,并死亡1只;生理鹽水對照組大鼠活動與食量正常,與灌胃前狀態(tài)相差不大。(2)各組采用S-N-K(S)法進(jìn)行比較,按α=0.05的水準(zhǔn),生理鹽水對照組、40mg/Kg組、80mg/Kg組、120mg/Kg組大鼠血漿ALT、BUN、CR含量存在明顯差異,且與劑量相關(guān)。采用非參數(shù)統(tǒng)計方法——Kruskal-Wallis H檢驗,按照α=0.05的水準(zhǔn),各組AST升高有差別。(3)采用HE染色觀察百草枯中毒大鼠肺損傷情況,結(jié)果顯示:生理鹽水對照組肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整,肺泡腔及肺間質(zhì)無滲出,無炎癥細(xì)胞浸潤。40mg/Kg組肺泡結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯改變,可見部分肺泡塌陷,肺泡腔及肺間質(zhì)可見少許滲出。80mg/Kg組、120mg/Kg組肺泡正常結(jié)構(gòu)基本消失,肺泡閉塞塌陷,肺間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤。(4)通過代謝物質(zhì)譜圖與NIST05標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫對比,選取相似度大于80%的組分作為已明確的代謝物組分進(jìn)行定性,共定性出30種代謝物,與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異的代謝物有14種,包括氨基酸、有機(jī)酸、糖類、脂肪酸。結(jié)合隨機(jī)森林算法分析差異代謝物對中毒大鼠代謝輪廓特征變化貢獻(xiàn)度發(fā)現(xiàn),d-Erythrotetrofuranose、丙酸、L-丙氨酸、D-果糖、谷氨酰胺、苯乙酸是關(guān)鍵差異代謝物。對4組大鼠鑒別起到重要作用的代謝物的代謝途徑主要是丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代謝。(5)采用典型相關(guān)對代謝物特征和臨床特征進(jìn)行分析,相關(guān)系數(shù)R為0.92,代謝物L(fēng)-脯氨酸,L-苯丙氨酸,酪氨酸、肌醇和生化指標(biāo)BUN對兩組特征的相關(guān)性貢獻(xiàn)最大。結(jié)論:(1)與對照組相比,中毒組出現(xiàn)各種癥狀時,肺損傷明顯,且糖代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、能量代謝均發(fā)生了改變。(2)與對照組相比,中毒組L-丙氨酸、L-脯氨酸、谷氨酰胺、L-酪氨酸含量下降,苯乙酸、L-絲氨酸、亞油酸、反亞油酸含量增加,且與中毒劑量相關(guān)。(3)對4組大鼠分類起到重要作用的代謝物的代謝途徑主要是丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代謝,其通過影響ATP代謝及氮平衡造成全身臟器損傷。(4)代謝物和肝腎功能指標(biāo)相關(guān)系數(shù)R為0.92,代謝物L(fēng)-脯氨酸,L-苯丙氨酸,酪氨酸、肌醇和尿素氮對兩組特征的相關(guān)性貢獻(xiàn)最大。
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R595.4
【圖文】：

3.1 大鼠一般情況在實驗室適應(yīng)的 2 天時間內(nèi)，所有大鼠性情溫順，毛發(fā)順而有光澤，飲食飲水良好，行動靈敏且好動，刺激后反應(yīng)迅速，對抓捕行為可敏捷躲避或有攻擊行為，體重隨著時間的延長而有所增加。對所有大鼠予以對應(yīng)的溶劑灌胃處理后（如圖 3-1 所示），大鼠均未出現(xiàn)口鼻部有生理鹽水或百草枯溶液溢出或嗆咳的現(xiàn)象，提示灌胃成功。40mg/Kg 中毒組大鼠灌胃后表現(xiàn)偶有躁動，毛發(fā)光澤變暗，飲食飲水減少等中毒癥狀，80mg/Kg 中毒組大鼠癥狀逐漸加重，出現(xiàn)閉眼，蜷縮少動，毛發(fā)變亂，呼吸急促，刺激后反應(yīng)變慢，120mg/Kg 中毒組反應(yīng)遲鈍，外界刺激下仍蜷縮不動，基本無飲水進(jìn)食活動，還出現(xiàn)呼吸費力、鼻部泡沫樣液體溢出等癥狀，并有 1 只大鼠死亡；生理鹽水對照組大鼠則飲食活動正常，生命體征平穩(wěn)，無不適癥狀。

見少許滲出。80mg/Kg、120mg/Kg 組肺泡正常結(jié)構(gòu)基本消失，肺泡閉塞塌陷，肺間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤。圖3-2 不同濃度組大鼠肺部病理切片鏡下觀（10×40倍鏡下）肺組織評分采用單因素方差分析可得 P<0.001，可得四組大鼠之間肺組織損

傷是有差異的；進(jìn)而采用 Tukey’s Multiple Comparison Test 進(jìn)行兩兩組間的對比，可得所有兩兩比較組間 P<0.05，任意兩組間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（如圖 3-3）。圖3-3 不同濃度組大鼠肺損傷半定量分析3.3 GC-MS 代謝組學(xué)分析3.3.1 GC-MS 定性分析前處理后的大鼠血漿樣品經(jīng)過 GC-MS 檢測后，共得到含 30 個小分子代謝物成分的總離子流圖（TIC），代表性譜圖見圖 3-4，可以看出圖譜中色譜峰數(shù)量豐富，大部分代謝物都滿足了完全分離。觀察空白組和攝毒組的血漿代謝物總離子流圖，可看出百草枯染毒的大鼠與正常大鼠的血漿小分子代謝物基本上一致，只是在代謝物的峰面積即含量上有區(qū)別。

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本文編號：2747834