【摘要】：燒傷膿毒癥的發(fā)生機制及治療方法一直是研究的熱點與重點。間充質(zhì)干細胞具有較強的抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用，可通過旁分泌各種細胞因子或與各種免疫細胞相互調(diào)節(jié)而發(fā)揮作用，用于炎癥性或免疫性疾病的治療。近年來已經(jīng)在GVHD、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性肺損傷、急性腎功能損害、急性免疫性肝損傷等疾病，脂肪間充質(zhì)干細胞取得了明顯的治療效果，但是針對嚴(yán)重?zé)齻摱景Y的治療研究仍然甚少，且具體機制仍不十分清楚。 首先，建立一個有效的完全模擬膿毒癥發(fā)病機制的動物模型及分離擴增培養(yǎng)獲得大量脂肪間充質(zhì)干細胞非常關(guān)鍵。在第一部分實驗，以C57/BL6J小鼠10%III°燙傷創(chuàng)面，接種2×10~5CFU銅綠假單胞菌建立小鼠燒傷膿毒癥模型。實驗結(jié)果：具有穩(wěn)定的膿毒癥發(fā)病率及死亡率，死亡率達50%-80%，；IL-1、IL-6、TNF-a及CRP等炎性因子明顯升高，IL-6最高達20ng/ml；心、肝、脾、肺及腎臟細菌含量增高，其中脾臟含量最高；各臟器炎性細胞浸潤及炎癥損傷嚴(yán)重，可見大量的炎性細胞浸潤及血性滲出；ALT、AST、BUN、Cr持續(xù)升高，腎功及肝功能明顯下降。該實驗表明該燒傷膿毒癥模型有較高的死亡率和可重復(fù)的穩(wěn)定性，并可進一步可發(fā)展為SIRS和MODS；該模型較好的反應(yīng)了燒傷膿毒癥的病理機制及臨床特征。 在第二部分實驗采用酶消化、貼壁篩選以及差速離心法分離培養(yǎng)小鼠脂肪間充質(zhì)干細胞，通過流式細胞分析獲得90%以上的CD90、CD105、CD44表達陽性，以及90%以上的CD34、CD45表達陰性的；同時通過油紅O及堿性磷酸酶染色證明該細胞是有向成脂、成骨多向分化能力的脂肪來源的間充質(zhì)干細胞。 在第三部分實驗在膿毒癥模型制備6h后，運用2×105脂肪間充質(zhì)干細胞輸注治療小鼠燒傷膿毒癥，觀察小鼠的一般狀況、生存率，檢測全身各臟器細菌及內(nèi)毒素定量、各臟器功能，以及促炎/抗炎因子的改變，明確脂肪間充質(zhì)干細胞在燒傷膿毒癥的治療作用。實驗結(jié)果表明：1、小鼠一般狀況、自主活動及對外界的反應(yīng)都有明顯改善；2、小鼠24h、48h至72h臟器的細菌含量明顯減少，而脾臟細菌定量變化最大，心臟的變化最��；3、隨時間延長，TNF-、IL-12表達明顯下降及抗炎因子IL-10表達明顯升高，血清中TNF-、IL-6等促炎癥因子及抗炎因子IL-10變化也是相同的。4、各臟器組織HE染色示炎性細胞浸潤明顯減少，肝小葉放射狀結(jié)構(gòu)保持完整；腎臟組織腎小管壞死細胞明顯減少，肺間質(zhì)增厚及肺泡內(nèi)的血性滲出明顯改善，肝、肺及腎臟組織細胞壞死凋亡明顯減少，臟器功能得到改善。這些實驗結(jié)果表明，脂肪間充質(zhì)干細胞治療燒傷膿毒癥得到了肯定的療效。 在第四部分實驗體外單獨或共培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細胞與Raw264.7小鼠巨噬細胞，以探討脂肪間充質(zhì)干細胞調(diào)節(jié)巨噬細胞及其NF-кB信號通路在干細胞治療膿毒癥可能的作用機制。將細胞分為四組：正常對照組、LPS刺激組、Transwell組、混合細胞組。實驗結(jié)果證明：1、經(jīng)LPS刺激后，促炎因子TNF-a、IL-6及抗炎因子TGF-b均有明顯升高，但隨時間延長，抗炎因子迅速下降，而促炎因子持續(xù)升高；當(dāng)細胞共培養(yǎng)時，促炎因子明顯下降，抗炎因子明顯升高，其中促炎因子TNF-a，及抗炎因子COX-2變化最明顯。2、經(jīng)LPS刺激24h后，CD206陽性細胞增幅10%；隨時間延長，LPS刺激組CD206陽性細胞無明顯變化；但細胞Transwell及混合細胞共培養(yǎng)組，分別由23.3%增至38.5%，24.2%增至52.7%，較LPS刺激組有顯著的提高，且發(fā)現(xiàn)，混合細胞組CD206的細胞比例最高，具有統(tǒng)計學(xué)差異。3、間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)組，細胞內(nèi)的P65的核轉(zhuǎn)位及其上游分子p-IKB-a、p-IKK-a的磷酸化水平明顯抑制。該實驗結(jié)果表明，脂肪間充質(zhì)干細胞可能不僅通過旁分泌的作用來調(diào)節(jié)巨噬細胞，還可通過與巨噬細胞間接觸而發(fā)揮調(diào)節(jié)的作用。其中PGE2及NF-кB信號通路可能是間充質(zhì)干細胞調(diào)節(jié)巨噬細胞變化的關(guān)鍵性因素，也是間充質(zhì)干細胞
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R459.7
【圖文】：

第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文細胞產(chǎn)生前列腺素的能力大大增強[11]。③環(huán)氧合酶抑制劑可以從多個患者的免疫功能，提高生存率[12][92]。核巨噬細胞系統(tǒng)的活化與作用毒素、炎性細胞因子及其分泌大量黏附分子、增加血管通透性，進一巨噬細胞向組織內(nèi)游走并轉(zhuǎn)化為巨噬細胞的過程。因此，單核巨噬細燒傷膿毒癥的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[13-14]。 M1/M2 型巨噬細胞

圖 2 TLR4 信號介導(dǎo)的 MyD88 依賴/不依賴的通路及 NF-кB 信號通路、 間充質(zhì)干細胞. 間充質(zhì)干細胞起源及生物特性1974 年 Friedenstein 等[25]發(fā)現(xiàn)貼壁的骨髓細胞在一定條件下可分化為成骨細胞骨細胞、脂肪細胞和肌肉細胞，而且這些細胞經(jīng)過多個培養(yǎng)周期仍可以保持多化的潛能。由于骨髓中的這種多能細胞能夠分化為多種中胚層來源的間質(zhì)細胞

tidine)和兩性霉素 B 共同作用，促使 BMSCs 體外分化[46]用 5-氮雜胞苷處理永生化小鼠 BMSCs 發(fā)現(xiàn) 24h 后變化，細胞相互鉸鏈形成肌管樣結(jié)構(gòu)，并可自主搏動，肽的表達。電鏡下可見類似心肌的超微結(jié)構(gòu)[94]。等[47]研究證實 MSCs 具有可以向肝細胞分化的能力，松、制瘤素、ITS+添加劑等混合誘導(dǎo)條件，觀察 21d，48d 后細胞進一步成熟，進一步通過 RT-PCR 定期檢白、白蛋白、細胞角蛋白 18、酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶等均呈持誘導(dǎo)后 1 周 70%的細胞表達白蛋白，6 周后肝細胞樣細8]采用含煙酞胺、β-巰基乙醇培養(yǎng)液將大鼠骨髓 MSCs免疫組化法分別檢測到胰島素-1 mRNA 和蛋白持續(xù)陽分化的細胞分泌胰島素的量遠遠超過未分化細胞。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 黃志偉;鞠秀麗;;間充質(zhì)干細胞的多向分化及其應(yīng)用研究新進展[J];國際兒科學(xué)雜志;2006年02期

2 王興宇 ,李昌麟 ,張勁松 ,馮衛(wèi)國 ,蘇踴躍 ,張宗梁;Effect of thermal injury on LPS-mediated Toll signaling pathways by murine peritoneal macrophages:inhibition of DNA-binding of transcription factor AP-1 and NF-κB and gene expression of c-fos and IL-12p40[J];Science in China(Series C:Life Sciences);2002年06期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 楊東明;人骨髓間充質(zhì)干細胞免疫原性及其相關(guān)機制的實驗研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2007年

本文編號：2750658