【摘要】：研究背景和目的：急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是各種致病因素損傷肺泡上皮細胞及微血管內(nèi)皮細胞,細胞間連接遭受破壞,所造成的以彌漫性間質(zhì)性肺水腫為主要病理特征,以急性低氧性呼吸功能不全為主要臨床特征的綜合征,是老年住院患者主要的死亡原因之一。盡管我們普遍認為膿毒血癥的病理過程涉及多種炎性細胞的激活、炎性介質(zhì)的釋放以及凝血因子的活化,但最終最直接的死亡原因是其導致的急性肺損傷引起的呼吸窘迫,目前除了機械通氣以外,臨床尚沒有有效的治療手段,其根本原因是我們對其發(fā)病機制缺乏充分的認識。開發(fā)出針對膿毒血癥性肺損傷的新型有效的治療方式需要我們對其進行深入的探索和研究。內(nèi)皮屏障的完整性是膿毒血癥急性肺損傷預后的決定性因素,因此改善膿毒血癥性肺損傷預后的關鍵在于維持內(nèi)皮屏障的穩(wěn)定性。血管內(nèi)皮鈣黏蛋白VE-cadherin (vascular endothelial cadherin)是內(nèi)皮細胞與細胞間粘著連接(adherent junction)的主要結(jié)構(gòu)基礎,它是一種跨膜受體,其胞外區(qū)域與鄰近細胞的VE-cadherin相結(jié)合,胞內(nèi)區(qū)域通過一系列肌動蛋白結(jié)合蛋白((a, β, y and p120 catenins)鉚定到細胞骨架MLC(myosin light chain, MLC)上。VE-cadherin的磷酸化和內(nèi)化,細胞骨架MLC重排產(chǎn)生應力纖維誘導的向心力,最終使相鄰細胞分開是增加細胞間滲透性的基本方式。任何能夠抑制VE-cadherin以及MLC磷酸化的分子都能夠減輕炎癥介質(zhì)誘導的血管滲透性增加。表氧化二十碳三烯酸(Epoxyeicosatrienoic Acid,EETs)是花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)的細胞色素P450表氧化酶(CYP450)代謝產(chǎn)物,其在多種病理狀態(tài)中均表現(xiàn)出血管保護作用,但關于其是否能增強血管內(nèi)皮屏障功能及其可能的分子生物學機制尚不得而知。之前關于膿毒血癥性肺損傷時肺組織中的炎細胞浸潤以及液體滲出情況的研究,大多數(shù)將焦點集中在炎癥或者炎細胞本身生物學特性的改變,而少有從內(nèi)皮細胞的角度探索炎細胞浸潤的分子機制,而本研究主要是為了探索細胞色素P450表氧化酶2J2(CYP2J2)系統(tǒng)對血管滲透性的影響及其機制。研究方法：在動物實驗部分,選取8-12周的雄性CYP2J2過表達以及周齡相匹配的同窩野生型小鼠,隨機分成四組：野生組(WT,給予生理鹽水腹腔注射)、LPS組(給予細菌脂多糖LPS 10mg/kg腹腔注射)、CYP2J2組(給予生理鹽水腹腔注射)、CYP2J2+LPS(給LPS10mg/kg腹腔注射)；除了使用轉(zhuǎn)基因鼠以外,我們還使用EET代謝酶sEH的抑制劑TPPU給小鼠灌胃以進一步證實CYP2J2系統(tǒng)對LPS誘導的血管滲透性的影響。在細菌脂多糖LPS處理后6小時：部分小鼠通過尾靜脈以2mg/100g的濃度注射伊文思藍(Evans blue)染液,1小時之后,通過右心室灌洗清除血管內(nèi)殘留的伊文思藍,然后取出肺拍照、勻漿經(jīng)甲酰胺處理后測OD值；部分小鼠行支氣管肺泡灌洗,收集灌洗液,離心后取上清檢測總蛋白濃度以及相關炎癥因子的表達；部分小鼠取出肺組織,或制備石蠟切片,或于-80凍存以備后續(xù)的髓過氧化物酶(MPO)活性檢測以及western檢測。在細胞實驗部分,我們使用LPS誘導臍靜脈內(nèi)皮細胞-細胞間發(fā)生結(jié)構(gòu)改變,使用sEH抑制劑AUDA來預處理以觀察AUDA誘導的內(nèi)源性EETs增加對LPS誘導的內(nèi)皮細胞間連接成分改變的作用及其具體的可能的分子生物學機制。一：探討CYP2J2在內(nèi)皮細胞中特異性高表達以及sEH抑制劑TPPU對小鼠膿毒血癥性急性肺損傷時血管滲透性的作用1.觀察腹腔注射LPS后120小時內(nèi)死亡率,繪制生存曲線2.HE染色：觀察肺間質(zhì)炎細胞浸潤情況3.MPO免疫組化：觀察肺間質(zhì)中性粒細胞的浸潤情況4.MPO活性檢測：肺間質(zhì)中性粒細胞的浸潤情況5.伊文思蘭染色和肺泡灌洗液的蛋白濃度測定：檢測蛋白的跨血管滲出情況6.肺濕重干重比：檢測血漿液體的跨血管滲出情況7. 免疫熒光：NG2、CD31免疫熒光染色觀察血管周細胞的數(shù)量二、sEH抑制劑AUDA對內(nèi)皮連接成分的作用其機制1. FITC-右旋糖苷transwell:檢測AUDA對LPS誘導的內(nèi)皮細胞單層滲透性增加的調(diào)節(jié)作用2. Western blot:檢測VE-cadherin的可溶成分和不可溶成分的轉(zhuǎn)換3. Western blot:檢測VE-cadherin和MLC的磷酸化修飾4.流式細胞術(shù)：檢測對LPS對內(nèi)皮細胞凋亡的作用三、AUDA調(diào)節(jié)內(nèi)皮滲透性的機制探索1. ROCK在AUDA調(diào)節(jié)內(nèi)皮滲透性中的作用2.氧化應激在AUDA調(diào)節(jié)ROCK介導的滲透性變化中的作用3.Src激酶在AUDA調(diào)節(jié)內(nèi)皮滲透性中的作用4.Src激酶對LPS誘導的氧化應激的作用研究結(jié)果：一、CYP2J2在內(nèi)皮細胞中特異性高表達緩解了小鼠膿毒血癥性急性肺損傷時血管滲透性的增加1. CYP2J2內(nèi)皮細胞特異性高表達降低了LPS膿毒血癥所致的死亡率2. CYP2J2內(nèi)皮細胞特異性高表達降低了膿毒血癥性急性肺損傷所致的肺間質(zhì)中炎細胞尤其是中性粒細胞的浸潤3. CYP2J2內(nèi)皮特異性高表達降低了膿毒血癥性急性肺損傷所致的肺間質(zhì)液體滲出4. CYP2J2內(nèi)皮特異性該表達降低了膿毒血癥性急性肺損傷所致的肺泡腔蛋白的滲出5. CYP2J2內(nèi)皮特異性該表達抑制了膿毒血癥性急性肺損傷所致的血管周細胞的丟失6.sEH抑制劑TPPU抑制了小鼠急性肺損傷時的血管滲透性增加二、 sEH抑制劑AUDA對內(nèi)皮連接成分的作用其機制1. AUDA減少了LPS所致的FITC標記的右旋糖酐的跨內(nèi)皮滲出2. AUDA減少了LPS所致的VE-cadherin由不可溶形式向可溶形式的轉(zhuǎn)化3. AUDA減少了LPS所致的細胞連接成分的磷酸化修飾4. 以上AUDA對內(nèi)皮屏障的維持作用并不是由減少細胞凋亡來實現(xiàn)的三、AUDA調(diào)節(jié)內(nèi)皮滲透性的機制探索1. AUDA是通過Rho-ROCK來調(diào)節(jié)內(nèi)皮滲透性的1) AUDA減少了LPS誘導的Rho活性增加2) AUDA減少了LPS誘導的Rho下游分子ROCK活性的增加,即減少了nypt(肌球蛋白磷酸酶)的磷酸化2. AUDA是通過調(diào)節(jié)ROS生成來調(diào)節(jié)Rho-ROCK介導的內(nèi)皮滲透性改變的1)氧化應激清除劑NAC減少了LPS誘導的ROS生成,緩解了LPS誘導的內(nèi)皮滲透性增加2)氧化應激清除劑NAC可以緩解LPS誘導的Rho-ROCK活化3) AUDA可以減少LPS誘導的ROS生成以及NOX2表達,與NAC作用相似4) AUDA緩解了H202直接誘導的滲透性改變,與NAC作用相似3. AUDA是通過調(diào)節(jié)GRP78與Src結(jié)合觸發(fā)的Src活化來調(diào)節(jié)內(nèi)皮滲透性的1) AUDA減少了GRP78與Src的結(jié)合以及Src的活化2)Src抑制劑PP1緩解了LPS誘導的內(nèi)皮滲透性增加3)Src抑制劑PP1緩解了LPS誘導的細胞連接成分(VE-cadherin)以及細胞骨架成分(MLC)的磷酸化4.GRP78與Src結(jié)合觸發(fā)的Src活化作用于ROS上游1)Src抑制劑PP1緩解了LPS誘導ROS生成2)Src抑制劑PP1緩解了LPS誘導NOX2表達3)Src抑制劑PP1緩解了LPS誘導ROCK活化結(jié)論：一、CYP2J2可以降低膿毒血癥性肺損傷,降低死亡率,抑制膿毒血癥性急性肺損傷所致的血管滲透性增加二、 CYP2J2可以減少細胞粘著連接成分VE-cadherin的磷酸化,以及細胞骨架MLC的磷酸化,從而減少細胞連接的開放三、 CYP2J2穩(wěn)定內(nèi)皮細胞間粘著連接的作用是通過抑制GRP78介導的Src活化,減少ROS生成,從而降低Rho-ROCK通路的活化來實現(xiàn)的關于AUDA如何調(diào)控GRP78與Src相互作用的機制,待后期實驗進一步探討。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R563.8
【圖文】：

存曲線的測定時，我們給予小鼠１５ｍｇ／ｋｇ的細菌脂多糖化ＰＳ）腹腔注射，隨后繼續(xù)飼逡逑養(yǎng)于ＳＰＦ級動物房并給予正常食水，每２４小時觀察一次，持續(xù)觀察記錄１２０小時。逡逑如圖２所示，第２４小時時，ＬＰＳ組的生存率為５０％，而Ｔｉｅ２Ｊ２過表達組的生存率為逡逑１００％；邋４８小時時ＬＰＳ組的生存率為２０％，而Ｔｉｅ２Ｊ２組小鼠的生存率為１００％；之后逡逑便不再有小鼠死亡。從生存曲線來看，內(nèi)皮特異性的２Ｊ２過表達顯著降低了腺毒血癥逡逑所致的死亡率。逡逑ｔ巧１邐＊逡逑２Ｊ２邋一三二■一一－？＾邋Ｉ邋仙－邐ｒ－ｈ逡逑Ｓ邋３０－邐ｉ逡逑Ｔｕｂｕｌｉｎ邐乏勸－逡逑分＾處邋＾邋巧。１１邋■邋１１邋，邋ＩＩ．，邋Ｉ邋Ｍ逡逑咬邐全邋《邋冷邋盧逡逑戶々？々／逡逑困１：左圖為ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測ＣＹＰ２Ｊ２蛋白質(zhì)在小鼠肺組織中的表達．右困為ＥＬＩＳＡ法測定血漿中逡逑１４，１５－ＥＥＴ的生成。與野生組相比較，Ｔｉｅ２Ｊ２轉(zhuǎn)基因組ＣＹＰ２Ｊ２表達顯著增加．１４．邋１５－ＥＥＴ明顯升苗．逡逑ＷＴ為野生型未予ＬＰＳ處理紀，ＷＴ＋ＬＰＳ為巧生型ＬＰＳ處理紀，Ｔｉｅ２Ｊ２為過表達未予ＬＰＳ處理組，逡逑Ｔｉｅ２Ｊ２＋ＬＰＳ為過表達ＬＰＳ處理組．逡逑２８逡逑

在發(fā)腺霉血殖性帥損傷時，各種導致血管n蟯感訶椉擁乃鶘艘蛩厥鼓諂は赴溴義狹悠蘋擔赴浞煜對黽櫻褐性黽擁難紫赴ㄖ饕侵行粵Ｏ赴┩ü鶘說膩義夏諂ぜ湎肚ㄒ頻剿ё櫓渲�。壤_跡乘荊櫻齲湃舊慕峁純�，蠂D雜諫韞U水逡逑處理的小鼠而言，ＬＰＳ增加了肺間質(zhì)中的炎細胞浸潤，但Qg皮特異性２Ｊ２離表達卻降逡逑低了邋ＬＰＳ誘導的肺組織間質(zhì)炎細胞的聚集；從ＭＰＯ免疫組化（圖４）邋＾心及ＭＰＯ活性逡逑檢規(guī)（圖５）的結(jié)果O喛�，晤U塹玫酵慕崧郟嘍雜諫硌嗡淼男∈�，ＬＰＳX楀義霞恿朔巫櫓停校系謀澩錚何從瑁蹋校癰骨蛔⑸浯淼哪諂ぬ匾煨裕玻剩瞶┍澩鐨∈�，其辶x希停校媳澩鏘嘍雜諼從瑁蹋校喲淼囊吧托∈笪廾饗圓畋穡歡玻剩采癱澩锏模蹋校喲礤義系男∈篤洌停校媳澩銼紉吧停蹋校幼櫚�，说明恼~ぬ匾煨裕玻剩補澩锝檔土隋澹蹋校佑盞煎義系模停校媳澩鐫黽櫻崾荊蹋校釉黽恿訟俁狙⑹狽渭渲手行粵Ｏ赴男罨�，而恼~ぬ劐義弦煨裕玻剩瞶┍澩錛跎倭隋澹蹋校佑盞嫉乃Ъ渲手行粵Ｏ赴罨�。Ｗ奢犪果提示恼~ぬ匾煨藻義希玻剩補澩錛跎倭酥行粵Ｏ赴目縉琳锨ㄒ

本文編號：2736611