【摘要】：目的:創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic Brain Injury,TBI)是由直接外力引起的腦組織結構破壞和功能障礙,具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點。TBI是青壯年死亡和殘疾的最主要的原因,全世界每年約近五千萬人會遭受腦挫傷。TBI所致腦損傷包括外力直接作用引起的原發(fā)性損傷以及隨后發(fā)生的繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷包括腦挫傷、腦血管損傷、軸索損傷等。繼發(fā)性損傷是直接損傷造成的一系列細胞及生化級聯(lián)反應,是導致腦損傷死亡或功能障礙的重要原因,包括氧化應激、谷氨酸興奮性毒性、炎癥反應、細胞凋亡等。氧化應激和炎癥是繼發(fā)性損傷的重要機制,理論上提高抗氧化反應和降低炎癥反應可以減輕TBI引起的繼發(fā)性腦損傷。核因子E2相關因子2(Nuclear factor-erythroid derived 2-related factors,Nrf2),屬于CNC-bZIP(cap‘n’collar subfamily of basic leucine zipper),即CNC亮氨酸拉鏈轉錄激活因子家族,是細胞抗氧化應激反應的中樞調(diào)節(jié)因子。生理狀態(tài)下,Nrf2與其胞漿蛋白伴侶分子Keap1(Kelch-like ECH associated protein1)結合形成穩(wěn)定的二聚體,并錨定于細胞質(zhì)的肌動蛋白上,導致Nrf2迅速泛素化和蛋白酶體依賴性的降解。當細胞處于氧化應激狀態(tài)下,受到親電子化合物或氧化物作用時,Nrf2和Keap1解偶聯(lián),由細胞質(zhì)轉移至細胞核內(nèi),與小Maf蛋白或其他bZIP蛋白結合成異二聚體,識別并結合抗氧化反應元件(Antioxidant response element,ARE)或親電子元件(Electrophile Response Elements,EpRE)上的相應序列,從而啟動下游基因的轉錄。研究表明,Nrf2在腦損傷和神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要的神經(jīng)保護作用。小鼠TBI后,Nrf2被激活,誘導細胞抗氧化反應。當小鼠缺乏Nrf2時,TBI引起更嚴重的氧化應激性損傷和功能障礙,Nrf2激動劑(包括蘿卜硫素、叔丁基苯二酚等)則可以明顯改善TBI引起的繼發(fā)性損傷。我們推測,Nrf2可能是臨床上治療腦挫傷的重要靶點。姜黃素(curcumin)是從姜黃Curcuma longa L中分離出來一種化合物。姜黃素具有抗炎和抗氧化等生物學活性。迄今為止,研究者已經(jīng)完成了100多項針對姜黃素的臨床試驗,這充分展現(xiàn)了姜黃素的安全性、耐受性及用于疾病治療的有效性。研究表明,在TBI和缺血再灌注損傷中,姜黃素可以通過血腦屏障進而發(fā)揮神經(jīng)保護作用,包括:改善腦水腫、炎癥、細胞穩(wěn)態(tài)、突觸可塑性等,但其分子機制目前尚不清楚。細胞和動物實驗研究表明,姜黃素可以激活Nrf2通路,但姜黃素是否通過激活Nrf2通路實現(xiàn)TBI后的神經(jīng)保護作用,目前尚不清楚。在本實驗中,內(nèi)源性Nrf2通路在小鼠TBI后被激活,我們首先研究了Nrf2在TBI后損傷周邊區(qū)神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞內(nèi)的表達變化,為法醫(yī)學實踐中推斷腦損傷時間尋找生物學標志物。接下來,我們應用WT和Nrf2-KO小鼠給予姜黃素或溶劑,研究姜黃素是否通過激活Nrf2通路實現(xiàn)TBI后的神經(jīng)保護作用,為臨床上以Nrf2為靶點開展神經(jīng)保護性治療提供依據(jù)。研究方法:取8 12周成年雄性野生(WT)小鼠和Nrf2敲除(Nrf2-KO)小鼠(20 26g),應用改良的Fenney的自由落體法制作中度腦挫傷模型。第一部分:將WT小鼠隨機分為假手術組(Sham)和腦挫傷組(TBI),并于TBI后1d、3d、7d和14d腹腔注射過量戊巴比妥鈉處死實驗小鼠并取腦組織。應用Western blot檢測TBI后不同時間段Nrf2的蛋白表達,同時應用免疫熒光染色檢測Nrf2在神經(jīng)元(NeuN)、星形膠質(zhì)細胞(GFAP)、小膠質(zhì)細胞(IBA1)和NG2膠質(zhì)細胞內(nèi)的表達變化。第二部分:將WT和Nrf2-KO小鼠分別隨機分為假手術組(Sham)和腦挫傷組(TBI),TBI組又隨機分為溶劑處理組(TBI+Veh)和姜黃素處理組(TBI+Cur)。TBI后24h腹腔注射過量戊巴比妥鈉處死實驗小鼠并取腦組織。應用Western blot和qRT-PCR檢測Nrf2及其下游基因(Hmox-1,Nqo1,Gclm,and Gclc)的蛋白和mRNA表達;檢測氧化應激性損傷(測定MDA水平)、腦水腫(測定brain water content)、神經(jīng)細胞變性(FJC、Tuj1免疫熒光染色)、細胞凋亡(Western blot檢測cleaved caspase-3、Bcl-2;TUNEL染色)及炎癥反應(qRT-PCR檢測TNF-α,IL-6和IL-1β;MPO、IBA1免疫熒光染色)等相關指標。結果:第一部分:Nrf2的蛋白表達水平在TBI后1d達到高峰,以后逐漸下降。TBI后Nrf2在神經(jīng)元內(nèi)呈一過性高表達,在傷后1d達到高峰,之后急劇減少。Nrf2在星形膠質(zhì)細胞內(nèi)呈持續(xù)性低表達,Nrf2陽性星形膠質(zhì)細胞數(shù)量在傷后7d達到高峰。TBI后Nrf2在小膠質(zhì)細胞內(nèi)表達明顯增高,Nrf2陽性小膠質(zhì)細胞數(shù)量在傷后7d達到高峰。我們也檢測了Nrf2在NG2膠質(zhì)細胞內(nèi)的表達,Nrf2在NG2膠質(zhì)細胞中的表達比率在傷后3d達到高峰。第二部分:在野生小鼠中,與溶劑處理組相比,姜黃素處理后,Nrf2及其下游基因表達水平明顯升高,而且Nrf2入核增加;氧化應激性損傷減輕,腦水腫改善,變性神經(jīng)細胞數(shù)量減少,存活神經(jīng)元數(shù)量增加,細胞凋亡明顯改善,炎癥反應降低。在Nrf2-KO小鼠中,Nrf2及其下游基因表達水平明顯降低;氧化應激性損傷、腦水腫加重,變性神經(jīng)細胞數(shù)量增加,存活神經(jīng)元數(shù)量明顯降低,細胞凋亡明顯加重,炎癥反應增強。Nrf2-KO小鼠給予姜黃素處理后,未出現(xiàn)在WT小鼠實驗中的明顯的神經(jīng)保護作用。結論:1、小鼠腦挫傷后,Nrf2在神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞內(nèi)表達增高。2、小鼠腦挫傷后,Nrf2在神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞內(nèi)表達存在時間規(guī)律性。3、小鼠腦挫傷后,內(nèi)源性Nrf2通路被激活,姜黃素處理后,Nrf2通路被進一步激活。4、姜黃素通過激活Nrf2通路實現(xiàn)TBI后的神經(jīng)保護作用。5、姜黃素通過激活Nrf2通路實現(xiàn)TBI后的抗炎、抗凋亡和抗氧化作用。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R651.15
【圖文】：

8圖 1 小鼠 TBI 后傷側皮質(zhì)損傷周邊區(qū)的形態(tài)學變化（A）小鼠中度腦挫傷模式圖，紅色區(qū)域為挫傷區(qū)，藍色與紅色之間區(qū)域為損傷周邊區(qū)；（B）小鼠中度腦挫傷后 24h，腦組織 HE 染色代表性圖片；（C）不同時間損傷周邊區(qū) HE 染色代表性圖片。Scale bar, 50 μm。3.2 小鼠 TBI 后傷側皮質(zhì)損傷周邊區(qū) Nrf2 蛋白表達應用WB檢測了小鼠不同損傷時間后傷側皮質(zhì)損傷周邊區(qū)Nrf2的蛋白表達水平。傷后 1d，Nrf2 蛋白表達水平明顯增高，隨后其表達水平逐漸下降（圖 2）。

圖 2 小鼠腦挫傷后不同時間 Nrf2 的 Western blot 檢測結果小鼠腦挫傷后不同時間損傷周邊區(qū) Nrf2 的蛋白表達水平。* p < 0.05 vs. 正常對照組 vs. 相鄰上一組 (n = 6).3 小鼠 TBI 后傷側皮質(zhì)損傷周邊區(qū)神經(jīng)元內(nèi) Nrf2 的表達免疫熒光染色結果顯示，在正常腦皮質(zhì)神經(jīng)元（NeuN+）內(nèi)，免疫熒光顯的 Nrf2 陽性熒光信號（表達）。腦挫傷后，NeuN 陽性細胞數(shù)量在傷明顯減少，之后趨于穩(wěn)定（圖3B）。傷后1d可見大量Nrf2陽性神經(jīng)元（NeuN+ 3C），其中，Nrf2 陽性神經(jīng)元占到神經(jīng)元數(shù)量的 80.2%（圖 3D，表 1）。 引起的神經(jīng)元內(nèi) Nrf2 高表達屬于一過性表達，在傷后 3d，表達 Nrf2 的明顯減少（圖 3C），Nrf2 陽性神經(jīng)元比率也顯著下降（圖 3D）。雖然在可見神經(jīng)元細胞核內(nèi) Nrf2 表達，但腦挫傷后神經(jīng)元內(nèi) Nrf2 表達主要集中

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 楊紹杰;孟金萍;屈yN;劉云波;;細胞凋亡信號傳導通路的研究進展[J];中國比較醫(yī)學雜志;2007年05期

本文編號：2722807