【摘要】：越來越多的研究表明,急性腦損傷后存在神經細胞的壞死和凋亡,而谷氨酸的興奮性毒性(Glutamic excitability toxicity)及鈣離子(Ca2+)內流被認為是整個過程的“發(fā)動者”。最新的研究已證實鈣整合素結合蛋白(Calcium-and Integrin-Binding Protein, CIB)可與多種蛋白及金屬離子相互作用,參與細胞黏附、細胞凋亡、DNA損傷修復等過程,但關于CIB在腦外傷后神經細胞的凋亡過程中發(fā)揮著何種作用則未見報道。亞低溫能夠減輕創(chuàng)傷性腦損傷后病理損害的程度,促進神經功能恢復,但其具體的保護作用機制仍未完全闡明。本研究對通過建立大鼠中度液壓顱腦損傷(Moderate traumatic brain injury,MTBI)模型,并給予亞低溫的干預措施,運用Western-blot、Real-time PCR、免疫組化等方法觀察亞低溫對腦損傷后鈣整合素結合蛋白(Calcium-and Integrin-Binding Protein, CIB)及N-甲基-D-天冬氨酸受體1(NMDAR1)表達的影響。本實驗證明了CIB1、CIB2與神經細胞的凋亡密切相關,而亞低溫的腦保護作用與抑制NMDAR1表達,從而減少Ca2+對CIB1、CIB2的抑制相關。 本實驗分為三部分：第一部分：大鼠液壓顱腦損傷及亞低溫模型的建立；第二部分：顱腦損傷后鈣整合素結合蛋白表達變化及神經細胞凋亡的研究；第三部分：亞低溫對腦損傷后鈣整合素結合蛋白表達及其腦保護機制的研究。 第一部分大鼠液壓顱腦外傷后常溫及亞低溫模型的建立 目的建立穩(wěn)定的常溫(normothermia)和亞低溫(mild hypothermia)治療液壓沖擊腦損傷(Fluid Percussion Injury,FPI)大鼠動物模型,并觀察評估模型的實用性及有效性,從而為深入開展創(chuàng)傷性顱腦損傷的相關動物實驗研究奠定基礎。 方法1.實驗動物及分組：雄性SD大鼠30只,隨機分為：假損傷組(Sham,n=10)；液壓腦損傷常溫組(TBI+N,n=10);液壓腦損傷亞低溫組(TBI+H,n=10)。2.液壓腦損傷動物模型建立及亞低溫的實施：亞低溫組大鼠TBI形成后立即予以冰浴降溫,使腦溫在15分鐘內下降至33.0±0.5℃,并維持該腦溫水平4h,之后在1h內復溫至正常水平(37±0.3℃),常溫組大鼠只致傷不降溫,保持腦溫在37+0.3℃,假損傷組大鼠僅做致傷前準備而不予以液壓打擊。所有實驗組動物在損傷前15分鐘至損傷后4小時均行各項生理參數(shù)檢測,每組各4只分別在液壓顱腦傷前后完成神經反射時間評分測試,行走實驗。另取每組各3只于傷后24h行大體標本觀察,3只行組織病理學分析(HE染色)。 結果所有生理參數(shù)除體溫外均在正常范圍內波動無統(tǒng)計差異,而損傷亞低溫組腦溫和肛溫較常溫有明顯差異(P0.01)。神經反射時間結果顯示在損傷后常溫組反射時間明顯增加,而在亞低溫組反射時間雖然較假損傷組有所增加但是和常溫組相比增加幅度明顯減弱(P0.01)。常溫組和亞低溫組大鼠TBI后行走試驗的逃脫時間較致傷前及假損傷組大鼠顯著延長(p0.01),亞低溫組大鼠逃脫時間較常溫組大鼠有明顯縮短(p0.01),而組織病理學分析顯示亞低溫組大鼠致傷灶周圍皮層和海馬腦損傷程度較常溫組大鼠明顯減輕。 結論我們成功地建立了符合臨床上顱腦損傷患者的神經行為學和組織病理學特點的大鼠常溫和亞低溫顱腦損傷模型,并對其有效性及實用性進行了評估,為下一步亞低溫對創(chuàng)傷行腦損傷后細胞凋亡作用機制的研究提供了良好條件。 第二部分顱腦外傷后鈣整合素結合蛋白表達變化及神經細胞凋亡的研究 目的檢測顱腦損傷對鈣整合素結合蛋白表達的影響,并觀察顱腦損傷后神經細胞凋亡變化,探討鈣整合素結合蛋白與神經細胞凋亡的關系。 方法第一部分采用側方液壓沖擊裝置,成功建立了大鼠中度腦損傷模型,在此基礎上,將104只SD大鼠隨機分為兩組：假損傷組(n=13)和損傷組(n=91)。損傷組分又為7個時間點(n=13/時間點)：1h、2h、4h、6h、12h、24h、72h。通過運用實時熒光定量RT-PCR和Western-blot技術來檢測大鼠海馬CIB1、CIB2在基因和蛋白水平的表達變化,并運用Tunel染色技術來檢測神經細胞的凋亡變化。 結果RT-PCR結果顯示mRNA的表達損傷組與假手術組相比,CIB1與CIB2在顱腦損傷后顯著上調(p0.01),傷后4h達到高峰,并在傷后72h接近假手術組(p0.05)。Western-blot結果表明CIB1、CIB2蛋白的表達量在傷后6h達到高峰(p0.01),在傷后72h與假手術組相比差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。Tunel染色結果顯示顱腦損傷后神經細胞的凋亡在傷后早期(1h)就可見到神經細胞凋亡的增加,傷后6h達到高峰而后逐漸下降至接近假手術組。 結論顱腦損傷后導致海馬鈣整合素結合蛋白CIB1、CIB2mRNA和蛋白表達的顯著改變并呈現(xiàn)出時程的變化；顱腦損傷后鈣整合素結合蛋白的表達改變可能與神經細胞的凋亡有密切關系。 第三部分亞低溫對顱腦外傷后鈣整合素結合蛋白表達及其腦保護機制的研究 目的檢測亞低溫對創(chuàng)傷性顱腦損傷后海馬組織中鈣整合素結合蛋白及N-甲基-D-天冬氨酸受體1在基因和蛋白水平的表達變化；初步探討鈣整合素結合蛋白與NMDAR1的關系及亞低溫的腦保護作用機制。 方法147只SD大鼠隨機分配于假損傷組(n=13)、損傷常溫組(37+0.3℃,n=52)和損傷亞低溫組(33.0+0.5℃,n=52)。損傷組(常溫組和亞低溫組)分4h (n=13)、6h (n=13)、12h (n=13)和24h(n=13)四個實驗時間段檢測。所有損傷組(常溫組和亞低溫組)每個時間段和假損傷組行實時熒光定量RT-PCR和Western-blot檢測(?)CIB1、CIB2、NMDAR1分別在基因和蛋白水平的表達變化(n=5/組)[常溫組第二部分已做],并結合Tunel染色方法檢測神經細胞凋亡情況(n=3/組)；同時進行神經行為學的觀察(n=5/組)。 結果CIB1、CIB2、NMDAR1表達在損傷常溫組較假損傷組明顯增加(p0.01),而亞低溫組雖較假損傷組增加(p0.05),但較常溫組表達量低(p0.05)。實時熒光定量RT-PCR和Western-blot結果顯示,與假手術組相比,亞低溫組鈣整合素結合蛋白CIB1、CIB2及NMDAR1在mRNA和蛋白水平的表達顯著降低(p0.05)。Tunel染色顯示亞低溫組與常溫組相比,神經細胞凋亡百分比顯著降低(p0.01)。 結論液壓腦損傷能夠導致大鼠海馬組織中CIB1、CIB2、NMDAR1基因和蛋白表達的上調,并可導致神經細胞凋亡的增加,而亞低溫的干預治療可以減少NMDAR1的表達并能夠明顯減少神經細胞的凋亡。在亞低溫治療的眾多腦保護作用機制中鈣整合素結合蛋白發(fā)揮著重要的作用,其作用的發(fā)揮與NMDAR1的表達相關,揭示了亞低溫啟動內源性神經保護并從源頭上阻斷凋亡進程的分子基礎及起效機制,從而為腦外傷的治療開創(chuàng)新的治療靶點提供理論基礎。
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R651.15

【參考文獻】

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1 周立田;王漢東;金偉;喬梁;唐科;茅磊;王笑亮;;Nrf2在腦外傷后細胞鈣離子穩(wěn)態(tài)及凋亡中的作用[J];醫(yī)學研究生學報;2010年05期

2 高廣偉;王志舉;;一氧化氮合酶對腦損傷后神經細胞凋亡的影響[J];中華神經外科疾病研究雜志;2007年06期

本文編號：2712875