【摘要】：越來(lái)越多的研究表明,急性腦損傷后存在神經(jīng)細(xì)胞的壞死和凋亡,而谷氨酸的興奮性毒性(Glutamic excitability toxicity)及鈣離子(Ca2+)內(nèi)流被認(rèn)為是整個(gè)過(guò)程的“發(fā)動(dòng)者”。最新的研究已證實(shí)鈣整合素結(jié)合蛋白(Calcium-and Integrin-Binding Protein, CIB)可與多種蛋白及金屬離子相互作用,參與細(xì)胞黏附、細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)等過(guò)程,但關(guān)于CIB在腦外傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡過(guò)程中發(fā)揮著何種作用則未見(jiàn)報(bào)道。亞低溫能夠減輕創(chuàng)傷性腦損傷后病理?yè)p害的程度,促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù),但其具體的保護(hù)作用機(jī)制仍未完全闡明。本研究對(duì)通過(guò)建立大鼠中度液壓顱腦損傷(Moderate traumatic brain injury,MTBI)模型,并給予亞低溫的干預(yù)措施,運(yùn)用Western-blot、Real-time PCR、免疫組化等方法觀察亞低溫對(duì)腦損傷后鈣整合素結(jié)合蛋白(Calcium-and Integrin-Binding Protein, CIB)及N-甲基-D-天冬氨酸受體1(NMDAR1)表達(dá)的影響。本實(shí)驗(yàn)證明了CIB1、CIB2與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡密切相關(guān),而亞低溫的腦保護(hù)作用與抑制NMDAR1表達(dá),從而減少Ca2+對(duì)CIB1、CIB2的抑制相關(guān)。 本實(shí)驗(yàn)分為三部分：第一部分：大鼠液壓顱腦損傷及亞低溫模型的建立；第二部分：顱腦損傷后鈣整合素結(jié)合蛋白表達(dá)變化及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的研究；第三部分：亞低溫對(duì)腦損傷后鈣整合素結(jié)合蛋白表達(dá)及其腦保護(hù)機(jī)制的研究。 第一部分大鼠液壓顱腦外傷后常溫及亞低溫模型的建立 目的建立穩(wěn)定的常溫(normothermia)和亞低溫(mild hypothermia)治療液壓沖擊腦損傷(Fluid Percussion Injury,FPI)大鼠動(dòng)物模型,并觀察評(píng)估模型的實(shí)用性及有效性,從而為深入開(kāi)展創(chuàng)傷性顱腦損傷的相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。 方法1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：雄性SD大鼠30只,隨機(jī)分為：假損傷組(Sham,n=10)；液壓腦損傷常溫組(TBI+N,n=10);液壓腦損傷亞低溫組(TBI+H,n=10)。2.液壓腦損傷動(dòng)物模型建立及亞低溫的實(shí)施：亞低溫組大鼠TBI形成后立即予以冰浴降溫,使腦溫在15分鐘內(nèi)下降至33.0±0.5℃,并維持該腦溫水平4h,之后在1h內(nèi)復(fù)溫至正常水平(37±0.3℃),常溫組大鼠只致傷不降溫,保持腦溫在37+0.3℃,假損傷組大鼠僅做致傷前準(zhǔn)備而不予以液壓打擊。所有實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物在損傷前15分鐘至損傷后4小時(shí)均行各項(xiàng)生理參數(shù)檢測(cè),每組各4只分別在液壓顱腦傷前后完成神經(jīng)反射時(shí)間評(píng)分測(cè)試,行走實(shí)驗(yàn)。另取每組各3只于傷后24h行大體標(biāo)本觀察,3只行組織病理學(xué)分析(HE染色)。 結(jié)果所有生理參數(shù)除體溫外均在正常范圍內(nèi)波動(dòng)無(wú)統(tǒng)計(jì)差異,而損傷亞低溫組腦溫和肛溫較常溫有明顯差異(P0.01)。神經(jīng)反射時(shí)間結(jié)果顯示在損傷后常溫組反射時(shí)間明顯增加,而在亞低溫組反射時(shí)間雖然較假損傷組有所增加但是和常溫組相比增加幅度明顯減弱(P0.01)。常溫組和亞低溫組大鼠TBI后行走試驗(yàn)的逃脫時(shí)間較致傷前及假損傷組大鼠顯著延長(zhǎng)(p0.01),亞低溫組大鼠逃脫時(shí)間較常溫組大鼠有明顯縮短(p0.01),而組織病理學(xué)分析顯示亞低溫組大鼠致傷灶周?chē)雍秃ｑR腦損傷程度較常溫組大鼠明顯減輕。 結(jié)論我們成功地建立了符合臨床上顱腦損傷患者的神經(jīng)行為學(xué)和組織病理學(xué)特點(diǎn)的大鼠常溫和亞低溫顱腦損傷模型,并對(duì)其有效性及實(shí)用性進(jìn)行了評(píng)估,為下一步亞低溫對(duì)創(chuàng)傷行腦損傷后細(xì)胞凋亡作用機(jī)制的研究提供了良好條件。 第二部分顱腦外傷后鈣整合素結(jié)合蛋白表達(dá)變化及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的研究 目的檢測(cè)顱腦損傷對(duì)鈣整合素結(jié)合蛋白表達(dá)的影響,并觀察顱腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡變化,探討鈣整合素結(jié)合蛋白與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)系。 方法第一部分采用側(cè)方液壓沖擊裝置,成功建立了大鼠中度腦損傷模型,在此基礎(chǔ)上,將104只SD大鼠隨機(jī)分為兩組：假損傷組(n=13)和損傷組(n=91)。損傷組分又為7個(gè)時(shí)間點(diǎn)(n=13/時(shí)間點(diǎn))：1h、2h、4h、6h、12h、24h、72h。通過(guò)運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western-blot技術(shù)來(lái)檢測(cè)大鼠海馬CIB1、CIB2在基因和蛋白水平的表達(dá)變化,并運(yùn)用Tunel染色技術(shù)來(lái)檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡變化。 結(jié)果RT-PCR結(jié)果顯示mRNA的表達(dá)損傷組與假手術(shù)組相比,CIB1與CIB2在顱腦損傷后顯著上調(diào)(p0.01),傷后4h達(dá)到高峰,并在傷后72h接近假手術(shù)組(p0.05)。Western-blot結(jié)果表明CIB1、CIB2蛋白的表達(dá)量在傷后6h達(dá)到高峰(p0.01),在傷后72h與假手術(shù)組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。Tunel染色結(jié)果顯示顱腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡在傷后早期(1h)就可見(jiàn)到神經(jīng)細(xì)胞凋亡的增加,傷后6h達(dá)到高峰而后逐漸下降至接近假手術(shù)組。 結(jié)論顱腦損傷后導(dǎo)致海馬鈣整合素結(jié)合蛋白CIB1、CIB2mRNA和蛋白表達(dá)的顯著改變并呈現(xiàn)出時(shí)程的變化；顱腦損傷后鈣整合素結(jié)合蛋白的表達(dá)改變可能與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡有密切關(guān)系。 第三部分亞低溫對(duì)顱腦外傷后鈣整合素結(jié)合蛋白表達(dá)及其腦保護(hù)機(jī)制的研究 目的檢測(cè)亞低溫對(duì)創(chuàng)傷性顱腦損傷后海馬組織中鈣整合素結(jié)合蛋白及N-甲基-D-天冬氨酸受體1在基因和蛋白水平的表達(dá)變化；初步探討鈣整合素結(jié)合蛋白與NMDAR1的關(guān)系及亞低溫的腦保護(hù)作用機(jī)制。 方法147只SD大鼠隨機(jī)分配于假損傷組(n=13)、損傷常溫組(37+0.3℃,n=52)和損傷亞低溫組(33.0+0.5℃,n=52)。損傷組(常溫組和亞低溫組)分4h (n=13)、6h (n=13)、12h (n=13)和24h(n=13)四個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間段檢測(cè)。所有損傷組(常溫組和亞低溫組)每個(gè)時(shí)間段和假損傷組行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western-blot檢測(cè)(?)CIB1、CIB2、NMDAR1分別在基因和蛋白水平的表達(dá)變化(n=5/組)[常溫組第二部分已做],并結(jié)合Tunel染色方法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況(n=3/組)；同時(shí)進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)的觀察(n=5/組)。 結(jié)果CIB1、CIB2、NMDAR1表達(dá)在損傷常溫組較假損傷組明顯增加(p0.01),而亞低溫組雖較假損傷組增加(p0.05),但較常溫組表達(dá)量低(p0.05)。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western-blot結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,亞低溫組鈣整合素結(jié)合蛋白CIB1、CIB2及NMDAR1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)顯著降低(p0.05)。Tunel染色顯示亞低溫組與常溫組相比,神經(jīng)細(xì)胞凋亡百分比顯著降低(p0.01)。 結(jié)論液壓腦損傷能夠?qū)е麓笫蠛ｑR組織中CIB1、CIB2、NMDAR1基因和蛋白表達(dá)的上調(diào),并可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的增加,而亞低溫的干預(yù)治療可以減少NMDAR1的表達(dá)并能夠明顯減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。在亞低溫治療的眾多腦保護(hù)作用機(jī)制中鈣整合素結(jié)合蛋白發(fā)揮著重要的作用,其作用的發(fā)揮與NMDAR1的表達(dá)相關(guān),揭示了亞低溫啟動(dòng)內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)并從源頭上阻斷凋亡進(jìn)程的分子基礎(chǔ)及起效機(jī)制,從而為腦外傷的治療開(kāi)創(chuàng)新的治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R651.15

【參考文獻(xiàn)】

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1 周立田;王漢東;金偉;喬梁;唐科;茅磊;王笑亮;;Nrf2在腦外傷后細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)及凋亡中的作用[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào);2010年05期

2 高廣偉;王志舉;;一氧化氮合酶對(duì)腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響[J];中華神經(jīng)外科疾病研究雜志;2007年06期

本文編號(hào)：2712875