發(fā)布時間：2020-05-19 08:29

【摘要】：研究背景:在急性高原缺氧、嚴重燒傷、創(chuàng)傷休克等條件下,心肌細胞均可能因缺氧損傷而導致自噬體(Autophagosome)累積,放大心肌損害,外部環(huán)境改變導致的心肌急性缺氧損傷是自噬流(Autophagy flux)阻斷的中心環(huán)節(jié)。自噬(Autophagy)是維持細胞在生理及病理狀況下代謝平衡的重要過程。在自噬進程中,溶酶體(Lysosome)需要維持酸性的腔內環(huán)境(p H 4.5-5.0)以保證腔內酸性水解酶的正常功能,溶酶體酸化對于自噬底物降解、維持自噬流通暢至關重要。然而,當機體遭遇各種環(huán)境使心肌細胞遭受急性缺氧損傷,溶酶體酸化出現(xiàn)障礙,腔內酸化水平減弱,阻礙了心肌自噬過程,導致自噬體得不到降解而逐步累積,溶酶體酸化障礙成為自噬流阻斷的重要原因。因此,研究溶酶體酸化機理,探究溶酶體酸化的調控因素,將為改善缺氧心肌的溶酶體酸化提供治療依據。人抗原R(Hu-Antigen R,HuR)是目前研究較為深入且廣泛的一種RNA結合蛋白,當細胞處于正常狀態(tài)下,HuR主要定位于細胞核,處于“非活化”狀態(tài),當細胞遭遇某些病理環(huán)境,HuR將在細胞核內結合多種m RNA并將m RNA“護送”至細胞質,這一過程中維持著所結合m RNA的穩(wěn)定同時促進m RNA翻譯過程,在既往研究中,多以HuR在細胞質中的富集作為其功能活化的判定標準。我們前期研究發(fā)現(xiàn),多種細胞自噬激活狀態(tài)下,都伴隨著HuR由胞核富集到胞質,提示HuR可能參與了細胞自噬過程。已有研究顯示,HuR能夠結合并維持溶酶體液泡型腺苷三磷酸酶(vacuolar H+ATPase,v-ATPase)部分亞基的m RNA的穩(wěn)定性,參與v-ATPase的分子水平調控。v-ATPase通過水解ATP產生的能量驅動胞質H+進入溶酶體,是溶酶體實現(xiàn)酸化并發(fā)揮降解功能的關鍵分子。然而,HuR與溶酶體酸化的相關性鮮有報道,我們猜測,在心肌細胞自噬過程中,HuR參與維持溶酶體酸化。當機體遭遇嚴重燒傷等狀況下,HuR的改變未見報道,我們猜測,HuR的功能障礙參與了燙傷后心肌自噬流損傷。本研究中,我們構建了小鼠背部30%TBSA三度燙傷模型,以及體外構建心肌細胞缺氧模型以模擬燙傷后心肌缺氧環(huán)境,研究燙傷后心肌自噬、溶酶體酸化改變以及HuR蛋白變化。并通過外源性調控HuR,探究其在心肌細胞自噬過程中對于溶酶體酸化的作用,為改善燙傷等病理環(huán)境下,心肌急性缺氧導致的溶酶體酸化障礙以及自噬流損傷提供基本理論依據。研究方法:1.以成年C57BL/6小鼠為研究對象,建立背部約30%TBSA三度燙傷模型,通過WB實驗檢測小鼠心肌自噬指標及HuR核漿分布情況。2.以原代培養(yǎng)C57BL/6小鼠乳鼠心肌細胞為研究對象,通過無糖培養(yǎng)基及缺氧環(huán)境構建心肌細胞急性缺氧模型。通過WB實驗檢測心肌細胞自噬水平變化,檢測全細胞總蛋白、胞質蛋白、胞核蛋白中HuR蛋白變化情況,同時通過免疫熒光染色(Immunofluorescence,IF),檢測HuR的蛋白分布水平變化及溶酶體酸化改變。3.利用HuR-小干擾RNA(HuR-si RNA,200n M)及HuR核漿轉運激活劑Cyclosporin A(Cs A,5.0?g/m L)處理細胞,下調或激活心肌細胞HuR并檢測溶酶體酸化水平及自噬水平改變,同時觀察心肌細胞的損傷及活力變化情況,明確HuR對心肌細胞溶酶體酸化的調控作用。4.使用HuR-si RNA和激活劑調控HuR,通過RT-q PCR及WB檢測無糖處理后ATP6V1E1的核酸及蛋白表達,明確HuR調控溶酶體酸化的作用環(huán)節(jié)。結果:1.小鼠30%TBSA三度燙傷后,心肌組織Hif-1?表達增加,提示缺氧損傷加重。自噬標志物ATG5表達明顯升高,自噬水平顯著升高,LC3、p62表達升高,提示自噬體累積,自噬流損傷加重,同時HuR核漿轉運未激活。進一步構建心肌細胞缺氧模型,檢測自噬相關指標,發(fā)現(xiàn)ATG5表達明顯升高,自噬水平顯著升高,LC3、p62表達升高,提示自噬體累積,自噬流損傷加重。同時,心肌細胞缺氧模型中,HuR核漿轉運受限,溶酶體酸化障礙。2.在缺氧環(huán)境中,利用激活劑Cyclosporin A(Cs A)上調HuR核漿轉運水平,檢測溶酶體酸化水平及溶酶體內組織蛋白酶D的蛋白水平,結果表明溶酶體酸化得到改善,溶酶體內組織蛋白酶含量增加,提示HuR對溶酶體酸化的調控作用。同時HuR激活后,心肌細胞活力有所增加,提示HuR對于維持缺氧心肌細胞功能發(fā)揮積極作用,激活劑Cyclosporin A能夠改善缺氧心肌細胞自噬及溶酶體酸化。3.利用無糖培養(yǎng)基建立HuR激活及溶酶體酸化陽性對照模型,檢測發(fā)現(xiàn)單純無糖環(huán)境能夠激活心肌細胞HuR核漿轉運及溶酶體酸化,通過HuR-si RNA干擾HuR表達,檢測溶酶體酸化水平及溶酶體內組織蛋白酶D的蛋白水平,結果表明溶酶體酸化顯著受到限制,溶酶體內組織蛋白酶含量下降,進一步證明HuR對溶酶體酸化的調控作用。同時HuR表達下調后,心肌細胞活力下降,提示HuR對于維持心肌細胞功能發(fā)揮積極作用。4.在缺氧環(huán)境下,利用激活劑上調HuR核漿轉運后,檢測v-ATPase亞基ATP6V1E1的核酸及蛋白水平,結果發(fā)現(xiàn)ATP6V1E1的核酸及蛋白水平升高;單純無糖環(huán)境中,下調HuR,重復上述檢測,結果提示ATP6V1E1的核酸及蛋白水平均顯著下降。提示HuR參與調控溶酶體上v-ATPase的分子穩(wěn)定。結論:缺氧心肌細胞自噬水平顯著升高,而HuR核漿轉運受限,溶酶體酸化障礙,導致自噬底物降解受阻,自噬流阻斷,造成心肌損害。利用激活劑上調HuR核漿轉運,能夠顯著改善溶酶體酸化水平。HuR能穩(wěn)定溶酶體上H+轉運體v-ATPase亞基ATP6V1E1m RNA的分子穩(wěn)定,從而維持ATP6V1E1的蛋白水平。以上結果提示HuR參與維持溶酶體酸化,而維持v-ATPase在細胞自噬激活后的持續(xù)表達是維持溶酶體酸化的重要調控機制,該結論進一步豐富了心肌自噬及溶酶體酸化的理論認識,通過調控HuR改善缺氧心肌溶酶體酸化,可能成為治療缺氧心肌自噬流損傷新的靶點。
【圖文】：

圖 2-1 小鼠背部 30%TBSA 三度燙傷/心肌細胞缺氧損傷對心肌自噬的影響2.2.2 小鼠背部 30%TBSA 三度燙傷后心肌組織及缺氧心肌細胞，，HuR 核漿轉運未激活根據 WB 結果顯示（圖 2-2），與對照組相比，燙傷不同時間點總蛋白中 HuR 表達差異無統(tǒng)計學意義（圖 2-2，A，B）（n=3，P>0.05 vs.sham）；燙傷 6h、12h、24h后心肌組織胞質蛋白中 HuR 表達降低（n=3，*P<0.05 或**P<0.01 vs.sham）；燙傷 12h、24h 后心肌組織胞核蛋白中 HuR 表達升高（圖 2-2，A，C，D）（n=3，*P<0.05 或**P<0.01vs.sham ） 。

圖 2-1 小鼠背部 30%TBSA 三度燙傷/心肌細胞缺氧損傷對心肌自噬的影響2.2.2 小鼠背部 30%TBSA 三度燙傷后心肌組織及缺氧心肌細胞，HuR 核漿轉運未激活根據 WB 結果顯示（圖 2-2），與對照組相比，燙傷不同時間點總蛋白中 HuR 表達差異無統(tǒng)計學意義（圖 2-2，A，B）（n=3，P>0.05 vs.sham）；燙傷 6h、12h、24h后心肌組織胞質蛋白中 HuR 表達降低（n=3，*P<0.05 或**P<0.01 vs.sham）；燙傷 12h、24h 后心肌組織胞核蛋白中 HuR 表達升高（圖 2-2，A，C，D）（n=3，*P<0.05 或**P<0.01vs.sham ） 。
【學位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R644

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本文編號：2670618