【摘要】：研究背景:急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory dirstress syndrome,ARDS)是臨床表現(xiàn)為雙肺彌漫性浸潤、進行性下降的頑固性低氧血癥的臨床綜合征,其肺部病理表現(xiàn)為肺組織被大量炎癥細胞浸潤、肺泡塌陷、肺間隔增寬及肺泡內透明膜形成。急性肺損傷(acute lung injury,ALI)以往被認為是ARDS的特定表現(xiàn),在2012年柏林標準中將其歸入ARDS中。但是在動物模型中模擬的ARDS過程,仍被被稱為ALI。膿毒癥是ARDS的最常見病因,其發(fā)生與細菌細胞壁脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)密切相關,因而LPS常用于誘導ARDS的動物模型。ARDS屬臨床急危重癥,其年發(fā)病率為75/100,000人次,病死率波動在35%至46%之間。盡管歷經半個世紀的研究,ARDS的發(fā)病機制仍不甚明了,人們嘗試了多種藥物及輔助治療手段治療ARDS,其中被證明有效的治療手段寥寥無幾,而藥物治療和分子治療無一能改善ARDS的死亡率。ARDS的主要治療方法仍為機械通氣呼吸支持治療。臨床的現(xiàn)實迫使我們對ARDS的發(fā)病機制及病理生理過程進入深入細致的研究,從中發(fā)掘潛在治療靶點及新的治療方法,以期攻克疾病。本質上,ARDS的發(fā)病機制是機體在遭受重大致病因素打擊后,劇烈炎癥級聯(lián)反應導致的廣泛肺損傷。因此ARDS后的炎癥修復與患者預后密切相關。Treg細胞被證實能夠促進ARDS炎癥的修復,在炎癥修復期有著重要的功能,肺內Treg細胞數量與增殖速度直接影響患者預后。同時,Nogo-B,網狀蛋白4的剪接體,廣泛表達于肺組織,已被證實在多種組織損傷后,如肝硬化、爆發(fā)性肝炎等的組織修復、炎癥控制等方面有著重要功能,并參與調控細胞增殖。但是,Nogo-B在ARDS炎癥后組織修復的作用,以及Nogo-B與Treg細胞間的作用關系尚無研究。本研究將探究LPS誘導的ALI小鼠模型炎癥修復過程中,Nogo-B扮演著什么角色,是否并且如何參與到炎癥修復過程。據我們所知,該內容尚無人報道。目的:明確Nogo-B在ALI小鼠模型炎癥修復期的作用,明確Nogo-B在Treg細胞急性肺損傷保護過程中的地位,以期能尋找ARDS炎癥修復期的關鍵蛋白靶點,為A RDS的救治尋找新的思路。方法:本研究通過LPS氣管滴注的方法構建ALI小鼠模型,采用迪夫快速染色法對BA L細胞BAL進行分類計數,HE染色觀察肺部病理變化,獲得ALI小鼠模型從發(fā)病第1天至第10天的病理生理發(fā)展特點與自然病程。通過流式細胞術檢測BAL中Treg的數量,明確ALI小鼠模型中BAL Treg細胞數量與炎癥修復各階段間的關系。同時,我們應用實時定量PCR技術檢測急性炎癥期和炎癥修復期ALI小鼠肺組織及BAL細胞N ogo-B的表達水平,并通過免疫熒光證實Nogo-B在Treg細胞中的表達,以期證實Nog o-B在ALI小鼠模型炎癥修復期中表達及Treg細胞中的表達變化。其次,我們采用CRISPR/Cas9技術構建Nogo-B基因敲除小鼠。分別使用Nogo-B基因敲除小鼠和野生型小鼠復制ALI模型,描繪兩組ALI模型小鼠的體重變化。采用迪夫染色對BAL細胞進行分類計數、HE染色觀察肺部病理組織改變,以觀察兩組A LI小鼠的炎癥修復期肺部損傷修復進程的差異,進一步明確Noog-B對ALI炎癥修復的影響。通過流式細胞術檢測兩組ALI小鼠BAL中Treg細胞數量變化情況,采用ELI SA檢測兩組ALI小鼠BAL及血清中IL-10、TGFβ及IL-2水平的變化情況。以期觀察兩組小鼠ALI炎癥修復期Treg細胞及抗炎因子。再次,我們采用腺病毒在體轉染的方法,給與Nogo-B敲除小鼠和野生型小鼠肺部過表達Nogo-B,并通過實時定量PCR及免疫熒光的方法驗證在體轉染的效果。復制ALI小鼠模型,通過細胞分類計數方法計算不同Nogo-B表達小鼠ALI模型中炎癥修復期中性粒細胞數量,通過肺組織HE染色觀察不同Nogo-B表達小鼠肺部病理損傷程度,以期明確Nogo-B過表達對ALI小鼠模型的炎癥修復進程的影響。使用流式細胞術檢測不同Nogo-B表達小鼠BAL中Treg細胞數量,以期明確Nogo-B對ALI炎癥修復期肺部Treg細胞數量的作用。而后,為明確Nogo-B在Treg對急性肺損傷的保護作用中的地位,我們使用過繼回輸方法,給Rag-/-小鼠ALI模型分別靜脈回輸Nogo-/-Treg細胞及WT Treg細胞,觀察各組ALI小鼠肺部病理損傷程度,BAL中性粒細胞數量,使用BCA蛋白定量測量各組ALI小鼠BAL中蛋白含量。為明確不同Nogo-B表達的Treg細胞肺部募集水平的差異,我們使用流式細胞術檢測以上各組ALI小鼠BAL中Treg細胞的數量。最后,為明確Nogo-B影響ALI小鼠模型肺部Treg細胞募集的作用機制,我們使用磁珠分選技術純化提取Nogo-B敲除的Treg細胞及野生Treg細胞,利用遷移實驗、增殖實驗驗證Nogo-B對Treg細胞遷移、增殖功能的影響。并采用TGF-β刺激分化No go-B敲除及野生初始型T細胞為Treg細胞,觀察Nogo-B對初始型T細胞分化的影響。采用ELISA方法,檢測激活的Nogo-B敲除Treg細胞及野生Treg細胞分泌IL-10的能力,以明確Nogo-B對Treg細胞分泌IL-10的影響。結果:一、ALI小鼠模型炎癥修復期的特點和Nogo-B的表達變化根據ALI小鼠模型BAL細胞學分類和肺組織病理變化,我們明確在LPS誘導后第4至7天機體處于炎癥修復期,第7天后為纖維化形成期。Treg細胞在第4天數量顯著升高,到第7天達到高峰,明確Treg參與了炎癥修復過。實時熒光定量PCR結果和免疫熒光結果顯示ALI小鼠肺組織和肺泡灌洗液細胞中Nogo-B的表達在炎癥修復期顯著升高,其變化趨勢與Treg數量變化趨勢一致。Treg細胞免疫熒光證實其表達Nog o-B蛋白。二、敲除Nogo-B基因后急性肺損傷炎癥修復受損我們采用CRISPR/Cas9技術構建C57BL/6背景Nogo-B-/-小鼠,并成功驗證Nogo-B-/-小鼠Nogo-B基因和蛋白表達缺失,提示Nogo-B敲除小鼠構建成功。ALI小鼠體重顯示,Nogo-B-/-小鼠與WT小鼠在LPS誘導后第3天,體重處于最低谷,第4天體重開始恢復,第7天WT小鼠體重恢復至原水平而Nogo-B-/-小鼠仍處于第4天水平。與WT小鼠相比,Nogo-B-/-小鼠ALI模型炎癥修復期BAL總細胞數和中性粒細胞數較高,肺部病理損傷較重,表明Nogo-B敲除后,ALI小鼠炎癥修復能力較差。Nogo-B-/-ALI小鼠炎癥修復期肺部Treg細胞數量較WT ALI小鼠低,BAL及血清中IL-10水平、IL-2水平較WT ALI小鼠低。表明Nogo-B敲除后,Treg細胞的肺部募集能力較差,肺部抗炎因子及Treg細胞增殖相關因子水平下降。三、過表達Nogo-B促進急性肺損傷的炎癥修復我們采用重組腺病毒氣道滴注的方式過表達Nogo-B,并使用實時定量PCR驗證該方法能夠在小鼠肺部過成功表達Nogo-B。Nogo-B過表達的ALI小鼠的炎癥修復期肺部病理損傷較對照組低,BAL中性粒細胞數較對照組低,表明Nogo-B過表達能夠恢復Nogo-B-/-敲除小鼠ALI模型炎癥的修復,促進ALI小鼠肺部炎癥修復。Nogo-B過表達小鼠ALI模型肺部Treg數量較對照組高,證明過表達Nogo-B能夠促進Treg細胞的肺部募集。四、Nogo-B在Treg細胞對ALI肺保護作用中的地位相比于WT Treg細胞,過繼回輸Nogo-B-/-Treg細胞無法修復Rag-/-小鼠ALI模型炎癥修復期肺部病理損傷,無法降低Rag-/-小鼠ALI模型炎癥修復期BAL中性粒細胞數量,無法降低Rag-/-小鼠ALI模型炎癥修復期BAL蛋白總量,提示Nogo-/-Treg細胞對ALI炎癥修復能力受損,反證Nogo-B在Treg細胞對ALI肺部的促進作用。相比于WT Treg細胞,過繼回輸Nogo-B-/-Treg細胞的Rag-/-小鼠ALI模型炎癥修復期Treg細胞數量下降,表明Nogo-B敲除的Treg細胞肺部募集能力受損。五、Nogo-B促進Treg細胞的增殖及分泌IL-10的能力采用磁珠分選技術,成功提取純度為95%作用的CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞。對比LPS刺激后WT Treg細胞與Nogo-B-/-Treg細胞遷移能力,結果顯示兩組細胞遷移能力無差異;對比TGF-β刺激下WT初始型T細胞與Nogo-B-/-初始型細胞分化為Treg細胞的能力,結果顯示兩組細胞分化能力無差異;對比CD3、CD28及IL-2刺激下WT Treg細胞與Nogo-B-/-Treg細胞增殖能力,結果顯示無論細胞濃度為多少,W T Treg細胞增殖能力強于Nogo-/-Treg細胞。對比CD3、CD28及IL-2刺激下WT Treg細胞與Nogo-B-/-Treg細胞分泌IL-10的能力,結果顯示WT Treg細胞分泌IL-10的強于Nogo-/-Treg細胞。結論:一、LPS氣管內滴注誘導的ALI小鼠模型炎癥修復期位于LPS誘導后第4天至第7天,該期間肺部Treg細胞數量顯著升高,Nogo-B的表達在炎癥修復期升高,其在炎癥修復期間的變化趨勢與Treg細胞變化趨勢一致。表明Nogo-B可能參與了 ALI模型的炎癥修復過程,且可能與Treg細胞相關。二、敲除Nogo-B基因使ALI小鼠肺部炎癥損傷加重,炎癥修復能力下降,肺部Treg細胞數量減少,證實Nogo-B參與ALI炎癥修復期的修復過程和Treg細胞的肺部募集。三、過表達Nogo-B可以使ALI小鼠肺部病理損傷得到修復,減少肺部炎癥細胞數量,增加肺部Treg數量,證實Nogo-B促進ALI小鼠的炎癥修復,促進Treg細胞的肺部募集。四、過繼回輸Noog-B基因敲除的Treg細胞無法修復Rag-/-小鼠ALI的炎癥損傷,無法使Treg細胞募集至肺部,證明Nogo-B對Treg細胞的肺部保護作用有著重要作用。五、Nogo-B基因敲除的Treg細胞增殖能力及分泌IL-10的能力下降。
【圖文】：

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【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R563.8

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