【摘要】：第一部分:兒茶酚交聯(lián)抗菌肽水凝膠預防燒傷創(chuàng)面多重耐藥鮑曼不動桿菌感染背景:醫(yī)院獲得性感染在燒傷患者中很常見,是造成燒傷患者病情加重甚至死亡的主要原因。鮑曼不動桿菌(A.baumannii)等細菌導致的創(chuàng)面感染很難治療,因為它們可以通過形成生物被膜等方式從而產(chǎn)生對抗生素的耐藥。故而我們應(yīng)當開發(fā)出一種新的材料用于治療燒傷創(chuàng)面的鮑曼不動桿菌的感染。水凝膠敷料被認為是傷口治療和護理的重要手段,目前已經(jīng)廣泛運用于臨床研究。水凝膠可以保持傷口表面的水分,對傷口的保濕至關(guān)重要。抗菌肽(AMPs)由于其利用物理的靜電相互作用通過破壞細菌細胞膜而殺菌,不會使細菌產(chǎn)生耐藥性以及其自身的安全性得到了廣泛關(guān)注。ε多聚賴氨酸(EPL)是一種常見的AMPs,以其對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌、酵母和霉菌的廣譜抗菌性能而聞名。而且EPL是一種水溶性可生物降解的物質(zhì),化學性質(zhì)穩(wěn)定的且毒性較低。兒茶酚是一種無色的天然有機化合物(C6H4(OH)2)。研究人員利用貽貝仿生原理將分子量小,水溶性好的兒茶酚與EPL交聯(lián)制備出抗菌水凝膠。該水凝膠可以用于燒傷創(chuàng)面的治療而且可以有效防止創(chuàng)面感染,在燒傷創(chuàng)面治療領(lǐng)域具有一定潛力。方法:水凝膠配方是EPL和兒茶酚,以貽貝作為交聯(lián)劑。通過將不同比例的EPL和鄰苯二酚,即凝膠1:(0.3:0.1)、凝膠2:(0.4:0.1)和凝膠3:(0.5:0.1)mol/L混合,制備成一系列EPL鄰苯二酚水凝膠。采用臨床多藥耐藥鮑曼氏菌(MRAB)為研究對象來研究水凝膠的體內(nèi)外抗菌和抗生物活性。用克隆小鼠成肌細胞系(C2C12)評價EPL兒茶酚水凝膠的生物相容性。此外,我們在小鼠背部皮膚表面造成二度燒傷創(chuàng)面,并用MRAB涂抹傷口形成感染性創(chuàng)面。為了評價水凝膠的體內(nèi)抗菌活性,對感染了第1天和第2天的創(chuàng)面上每克組織進行了細菌的計數(shù)。采用掃描電鏡觀察水凝膠對鮑曼氏菌的體內(nèi)外抗菌作用。同時,將EPL兒茶酚水凝膠覆蓋到小鼠創(chuàng)面,觀察它通過抑制細菌感染來促進傷口愈合的作用,并研究相關(guān)機制。結(jié)果:通過對水凝膠的掃描電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)了 EPL鄰苯二酚水凝膠的高度交聯(lián)的多孔結(jié)構(gòu)。不同比例的水凝膠中,隨著EPL濃度的增加,孔徑減小。水凝膠的含水量從87%到94%不等。體外研究表明:EPL兒茶酚水凝膠對MRAB有很好的抗菌活性。隨著EPL濃度的增加,EPL兒茶酚水凝膠對鮑曼不動桿菌的抑制也會增強。在EPL兒茶酚水凝膠與鮑曼不動桿菌過夜培養(yǎng)之后發(fā)現(xiàn)該水凝膠對MRAB具有100%的殺傷力。掃描電鏡分析表明:經(jīng)EPL-鄰苯二酚水凝膠處理后,MRAB的表面形態(tài)發(fā)生了明顯的破壞,產(chǎn)生了萎縮和起皺等結(jié)構(gòu)變化。更為重要的是EPL兒茶酚水凝膠可以抑制MRAB生物膜的形成�？股锬ぴ囼灡砻�:與TCPS(對照組)相比,EPL-鄰苯二酚水凝膠處理之后只觀察到少量活/死的MRAB細胞,而對照組中大多數(shù)細菌是活的(染成綠色),并且形成了生物被膜的結(jié)構(gòu)。此外,EPL兒茶酚水凝膠對克隆小鼠成肌細胞系(C2C12)具有良好的體外生物相容性。在EPL-鄰苯二酚水凝膠中,細胞呈周期性生長。燒傷創(chuàng)面接種MRAB,覆蓋了水凝膠后,創(chuàng)面的細菌數(shù)量log10值較對照組降低了4.76。使用水凝膠48小時后,與對照組相比,觀察到稍微上升到至5.70,但和對照組相比,仍然沒有發(fā)生感染跡象。掃描電鏡觀察顯示,與對照組相比,EPL兒茶酚水凝膠治療的MRAB感染燒傷創(chuàng)面上細菌生長較少,而對照組MRAB大量增殖。在組織學研究中,與未經(jīng)治療的對照組相比,在小鼠局部應(yīng)用EPL兒茶酚水凝膠的第1天和第2天未發(fā)現(xiàn)炎癥細胞浸潤、水腫或充血。此外與未經(jīng)治療的對照組相比,第2天和第5天小鼠皮下植入水凝膠后,顯示表皮、真皮和皮下組織結(jié)構(gòu)正常,無炎癥跡象。這些結(jié)果表明,EPL兒茶酚水凝膠具有良好的生物相容性。結(jié)論:本研究首次建立了一種EPL與鄰苯二酚交聯(lián)的多孔水凝膠。通過這項研究,我們證明了這種水凝膠不僅具有體外抗菌作用,而且能夠抑制MRAB生物膜活性。同時EPL兒茶酚水凝膠對哺乳動物細胞具有良好生物相容性且無細胞毒性。體外和體內(nèi)研究均表明處理后實驗組細菌數(shù)量顯著減少。使用水凝膠后對小鼠皮膚的組織學檢查沒有任何炎癥和組織改變的跡象�；谶@些結(jié)果,我們得出結(jié)論,EPL兒茶酚水凝膠是一種具有優(yōu)良的體外抗鮑曼不動桿菌效果以及具有體內(nèi)生物相容性的新型材料。有望將來能夠應(yīng)用于臨床的燒傷創(chuàng)面感染治療。第二部分:基于貽貝仿生的接觸抗菌水凝膠的設(shè)計以及體內(nèi)促傷口愈合的研究背景:開放性傷口(如燒傷和創(chuàng)傷)總是受到各種病菌的感染。一旦遭受了細菌的感染就會延緩傷口的愈合,所以迫切需要開發(fā)一種新型的創(chuàng)面敷料,既能防止細菌的感染,又能促進傷口愈合。我們受海洋貽貝足絲的啟發(fā),開發(fā)了一種新型的抗菌水凝膠用于開放性傷口治療�？咕�(AMP)通過物理靜電相互作用而破壞了微生物的細胞膜,被認為不會對細菌產(chǎn)生耐藥性。ε多聚賴氨酸(EPL)是蛋白鏈霉菌產(chǎn)生的一種天然抗菌肽,具有很強的廣譜抗菌性能。與其他AMP不同的是,發(fā)酵生產(chǎn)EPL的成本相對較低�；贓PL的衍生物已被用于制備具有體外抗菌活性的水凝膠。然而這些水凝膠的制備通常涉及多個化學合成步驟,如EPL分子的修飾。貽貝仿生化學發(fā)生在溫和的環(huán)境中,是一種簡便制備材料的方法。最近的研究報告了鄰苯二酚和多胺之間的反應(yīng)。兒茶酚的酚基與胺反應(yīng)生成了貽貝足絲蛋白樣的薄膜。含25-30賴氨酸的EPL是一種典型的多胺類化合物,具有豐富的側(cè)胺基團,可以與EPL兒茶酚反應(yīng)生成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。這項工作提出了一種新開發(fā)的兒茶酚和EPL水凝膠,具有治療MRSA感染和加速傷口愈合的功能。方法:合成了三種EPL兒茶酚水凝膠。EPL(10、20和30 mmol/L)和鄰苯二酚(30 mmol/L),即凝膠 1:(10:30)、凝膠 2:(20:30)和凝膠 3:(30:30)mmol/L混合。用掃描電鏡觀察了水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。測定了水凝膠對大腸桿菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抗菌活性。并且利用掃描電鏡觀察細菌形態(tài)。還利用活/死細菌染色觀察EPL兒茶酚水凝膠的抗生物被膜的能力。采用C2C12細胞系測定EPL兒茶酚水凝膠的體外生物相容性�；谝陨象w外的研究,我們開展了水凝膠在體內(nèi)的研究,我們建立了感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的小鼠燒傷創(chuàng)面,觀察EPL兒茶酚水凝膠的體內(nèi)抗感染效果。采用蘇木精和伊紅(HE)染色、IL-6和TNF-α的免疫組化染色和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的免疫熒光標記分析EPL兒茶酚水凝膠的抗炎效果和促傷口愈合特性。結(jié)果:以鄰苯二酚為交聯(lián)劑,合成了 EPL兒茶酚水凝膠。EPL兒茶酚水凝膠呈褐色,鄰苯二酚氧化為醌。EPL兒茶酚水凝膠在水中迅速膨脹。水凝膠EPL兒茶酚中隨著EPL含量升高,溶脹率也增加。通過SEM的圖像顯示水凝膠出現(xiàn)了多孔結(jié)構(gòu)。EPL兒茶酚水凝膠對大腸桿菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌均具有抗菌活性。EPL兒茶酚(凝膠1)減少了 79.2%的大腸桿菌和59.4%的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。EPL兒茶酚(凝膠2)水凝膠對大腸桿菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的殺滅率分別增加了 99.8%和97.5%。EPL兒茶酚(凝膠3)水凝膠對大腸桿菌和MRSA的抗菌效果最強,99.999%和99.9%殺死的殺滅率。我們利用共聚焦顯微鏡能夠在石英片上觀察到生物膜的形成(對照組)。然而,利用EPL兒茶酚(凝膠3)水凝膠處理的對照組則沒有生物被膜的形成,說明水凝膠可以抑制了生物膜的形成。EPL兒茶酚水凝膠在第1天和第3天的體外細胞毒性與對照組(TCPS)相比生長速度穩(wěn)定,表明EPL兒茶酚水凝膠無細胞毒性。與TCPS對照組相比,EPL兒茶酚水凝膠能增加小鼠微血管內(nèi)皮細胞的遷移,說明EPL兒茶酚水凝膠有助于新生血管的形成。在體內(nèi)抗菌研究中,我們觀察了 EPL兒茶酚水凝膠在MRSA感染燒傷創(chuàng)面上的治療3天,與對照組相比顯著降低了 99.9%和99.8%(P0.01)。蘇木精和伊紅(HE)染色顯示對照組(生理鹽水組)和聚乙二醇(PEGDA)水凝膠組在第1天和第3天有大量炎性細胞(藍色)浸潤。另一方面,EPL兒茶酚水凝膠降低了 MRSA感染燒傷部位的炎癥效應(yīng)。此外,通過掃描電鏡觀察顯示:EPL兒茶酚水凝膠降低了燒傷創(chuàng)面MRSA的感染。與對照組(生理鹽水組)和PEGDA相比,EPL兒茶酚水凝膠具有顯著的傷口修復和皮膚再生性能。EPL兒茶酚水凝膠治療10天創(chuàng)面與生理鹽水組和PEGDA水凝膠組相比幾乎完全閉合。第3天的組織學分析顯示用EPL兒茶酚水凝膠治療的傷口炎癥細胞減少。第6天,EPL兒茶酚水凝膠治療組出現(xiàn)毛囊和血管,而生理鹽水和PEGDA治療組未見毛囊和上皮。第10天,EPL兒茶酚水凝膠治療組與生理鹽水組相比,出現(xiàn)大量毛囊、血管和完全表皮,PEGDA組出現(xiàn)輕度急性炎癥反應(yīng)。這些結(jié)果表明EPL兒茶酚水凝膠可以促進傷口愈合。此外,免疫組化染色顯示EPL兒茶酚水凝膠促炎細胞因子的表達較少,表明其具有抗炎活性,有助于傷口愈合。與其他兩個對照組(生理鹽水組和PEGDA組)相比,EPL兒茶酚水凝膠在第3天、第6天和第10天顯示高血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達。結(jié)論:在這項研究中,我們設(shè)計了一種基于貽貝仿生的抗菌水凝膠。在室溫下采用一步法直接將EPL與鄰苯二酚交聯(lián)。EPL兒茶酚水凝膠具有明顯的接觸抗菌作用。體外實驗表明,EPL兒茶酚水凝膠不僅對大腸桿菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌有顯著的殺菌作用,而且具有防止細菌生物膜形成的功能。此外,EPL兒茶酚水凝膠與小鼠成肌細胞(C2C12)具有良好的生物相容性,促進了小鼠血管內(nèi)皮細胞的體外遷移。更重要的是,在燒傷創(chuàng)面感染和全層皮膚創(chuàng)面動物模型顯示,EPL兒茶酚水凝膠不僅能抑制燒傷創(chuàng)面MRSA感染,而且通過減少促炎性細胞因子IL-6和TNF-α的表達,增加血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達來促進創(chuàng)面愈合。這些結(jié)果表明,EPL兒茶酚水凝膠是一種很有前途的用于傷口敷料的材料,可以預防傷口感染,加速傷口愈合。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R644

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本文編號：2663679