發(fā)布時間：2020-05-02 19:22

【摘要】：第一部分滇重樓總皂苷對LPS刺激離體腸上皮屏障功能障礙的影響[目的]脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激人結腸腺癌Caco-2細胞腸上皮單層細胞模型,給予滇重樓總皂苷(Rhizoma Paridis of yunnan of total saponin,RPTS)干預,并用晚期炎癥因子高遷移族蛋白B1(Highmobility group proteinB1,HMGB1)的抑制劑丙酮酸乙酯(Ethyl pyruvate,EP)進行對照,觀察RPTS對LPS誘導離體腸上皮屏障功能障礙及HMGB1釋放的影響。[方法]將人結腸腺癌Caco-2細胞按5× 1 05個/ml接種于Transwell小室上室(500μl/孔)構建腸上皮單層細胞模型,隨機分為5組(n=12孔/組):空白對照組(Control組)、模型組(LPS組)、滇重樓總皂苷治療組(RPTS+LPS組)、滇重樓總皂苷組(RPTS組)、治療對照組(EP+LPS組)。采用跨上皮電阻儀定期測定跨上皮電阻值(Transepithelial electrical resistance,TEER值),當TEER值500 Ω·cm2時腸上皮單層細胞模型構建成功,給予各組不同處理,LPS 組、RPTS+LPS 組、EP+LPS 組給予 LPS100 μg/ml,RPTS+LPS 組、RPTS.組給予RPTS1μg/ml,EP+LPS組給予EP50μg/ml。分別于處理后0、6、12、24h測定TEER值,于處理后24h測定異硫氰酸熒光素(FITC)-右旋糖酐通透率(Permeability coefficient of FITC,PF),于處理后 6、12、24 h 應用 RT-PCR和Western-blot測定HMGB1 mRNA和蛋白表達水平。[結果]①倒置顯微鏡觀察可見,LPS組細胞數(shù)目顯著減少,分布不均勻,細胞形態(tài)不規(guī)則,折光性減弱,部分區(qū)域有缺失空洞形成,沿孔洞邊緣有片狀單層細胞飄起,培養(yǎng)液渾濁,漂浮細胞多。RPTS+LPS組較LPS組細胞數(shù)量多,形態(tài)較規(guī)則,漂浮細胞較少,折光性較好,培養(yǎng)液較清。RPTS組、EP+LPS組與Control組無明顯差異。②檢測TEER值發(fā)現(xiàn),與Control組比較,LPS組6h、12h、24hTEER值均降低,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05),24h時下降超過OhTEER值的一半。與 LPS 組比較,RPTS+LPS 組、RPTS 組及 EP+LPS 組 6h、12h、24h TEER值均升高,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。③檢測FITC-右旋糖酐通透率PF發(fā)現(xiàn),與Control組比較,LPS組24hPF顯著升高,差異顯著有統(tǒng)計學意義(P0.005)。與 LPS 組比較,RPTS+LPS 組、RPTS 組及 EP+LPS 組 24hPF均降低,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。④檢測Caco-2細胞HMGB1mRNA和蛋白表達水平發(fā)現(xiàn),與Contro1組比較,LPS組6h、12h、24hHMGB1mRNA和蛋白表達水平均顯著升高,差異顯著均有統(tǒng)計學意義(均P0.005)。與LPS組比較,RPTS+LPS 組、RPTS 組及 EP+LPS 組 6h、12h、24h HMGB1 mRNA 和蛋白表達水平均顯著降低,差異顯著均有統(tǒng)計學意義(均P0.005)。⑤LPS組.各時間段(6h、12h、24h)晚期炎癥因子HMGB1蛋白表達水平與TEER值呈顯著負相關,差異顯著均有統(tǒng)計學意義(均P0.005)。[結論]體外實驗表明,滇重樓總皂苷可能通過下調(diào)Caco-2細胞晚期炎癥因子HMGB1表達,改善腸上皮屏障通透性和完整度,抑制腸上皮屏障功能障礙進展,從而起到腸道功能保護作用。第二部分滇重樓灌胃對膿毒癥大鼠腸道功能障礙及小腸HMGB1表達的影響[目的]脂多糖(LPS)誘導膿毒癥(sepsis)大鼠腸道功能障礙,給予不同濃度滇重樓(RhizomaParidisofyunnan,RP)灌胃,探討滇重樓灌胃對膿毒癥大鼠腸道功能障礙及小腸高遷移率族蛋白B1(HMGB1)表達的影響。[方法]清潔級成年SD大鼠150只,雌雄各半,隨機分為5組(n=30只/組),分別為對照組、模型組、滇重樓低劑量組(滇重樓20mg/kg.po)、滇重樓中劑量組(滇重樓40mg/kg.po)、滇重樓高劑量組(滇重樓80mg/kg.po)。構建膿毒癥大鼠模型(LPS1mg/kg.iv),給予各組不同處理,滇重樓低、中、高劑量治療組分別予以滇重樓20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg灌胃,對照組和模型組予以等量生理鹽水灌胃,連續(xù)觀察大鼠行為學變化及死亡率。于灌胃治療后7d,取動脈血檢測血中白細胞數(shù)(WBC)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)、肌酐(Cre)、乳酸(Lac)的含量。分別于灌胃治療后1d、3d、7d、14d,行小腸推進率檢測,并取小腸行HE染色及病理組織學評分,采用ELISA法檢測小腸中HMGB1蛋白表達水平;同時,取血漿用ELISA法檢測血漿二胺氧化酶(Double amine oxidase,DAO)活性。[結果]①與對照組比較,模型組大鼠死亡率和小腸推進率均升高,滇重樓低、中、高劑量組小腸推進率均降低,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。與模型組比較,滇重樓低、中、高劑量組大鼠死亡率和小腸推進率均降低,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。②于治療后7d檢測大鼠血液指標發(fā)現(xiàn),與對照組比較,模型組大鼠全血中ALT、CK-MB、Cre含量升高,WBC含量均下降,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05);Lac含量稍有升高,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。與模型組比較,滇重樓低、中、高劑量組全血中ALT、CK-MB、Cre含量均下降,WBC含量升高,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05);Lac稍有降低,但差異均無統(tǒng)計學意義(均P0.05)。③根據(jù)HE染色結果進行病理組織學評分,與對照組比較,模型組病理組織學評分Ⅲ級百分比顯著升高,差異顯著有統(tǒng)計學意義(P0.005)。與模型組比較,滇重樓低、中、高劑量組病理組織學評分Ⅲ級百分比均顯著下降,差異顯著均有統(tǒng)計學意義(均P0.005)。④不同處理后1d、3d、7d、14d,與對照組比較,模型組1d、3d、7d、14d血漿DAO活性和小腸HMGB1蛋白表達水平均升高,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。與模型組比較,滇重樓低、中、高劑量組1d、3d血漿DAO活性和小腸HMGB1蛋白表達水平均稍有下降,但差異均無統(tǒng)計學意義(均P0.05);滇重樓低、中、高劑量組7d、14d血漿DAO活性和小腸HMGB1蛋白表達水平均下降,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。⑤模型組各時間段(1d、3d、7d、14d)小腸HMGB1蛋白表達水平與血漿DAO活性呈顯著正相關(均P0.005)。[結論]體內(nèi)實驗表明,滇重樓灌胃可能通過抑制HMGB1表達參與抗炎反應,改善小腸粘膜屏障通透性,抑制腸道功能障礙,從而發(fā)揮腸道功能保護作用。
【圖文】：

進小鼠粒／巨噬細胞克隆形成細胞（ＧＭ－ＣＦＣ）活化，增強細胞吞噻能力［２５］。Ｐ－逡逑蛻皮激素、鞣質(zhì)、葉多糖（ＰＰＬＰｓ）也具有抑菌及免疫調(diào)節(jié)活性。此外，滇重樓逡逑內(nèi)生真菌可誘導生成萬古霉素衍生物，直接參與抗炎反應［２６］；重樓還可刺激糖皮逡逑質(zhì)激素分泌，通過下丘腦－垂體－腎上腺軸（ＨＰＡ）間接參與抗炎反應［２７］。邐■—逡逑因此，本研宄擬通過ＬＰＳ刺激人結腸腺癌Ｃａｃｏ－２細胞單層上皮模型模擬離逡逑體腸上皮屏障功能障礙，并通過運用滇重樓總阜苷（Ｒｈｉｚｏｍａ邋Ｐａｒｉｄｉｓ邋ｔｏｔａｌ逡逑ｓａｐｏｎｉｎｓ，ＲＰＴＳ）進行干預，采用Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ、ＲＴ－ＰＣＲ、跨上皮電阻測定等技逡逑術探討ＬＰＳ誘導下的腸上皮細胞中ＨＭＧＢ１的表達規(guī)律。明確滇重樓總皂苷在逡逑ＬＰＳ刺激離體腸上皮屏障功能障礙中的作用機制及對晚期炎癥因子ＨＭＧＢ１表達逡逑的影響，進而為腸上皮屏障的損傷、修復機制及阻止腸上皮屏障受損導致膿毒癥逡逑和ＭＯＤＳ提供新的治療策略和理論依據(jù)。逡逑

為Ｃａｃｏ－２細胞生長曲線，２－Ｂ為ＬＰＳ最佳刺激濃度，２－Ｃ為ＲＰＴＳ與１００（ａｇ／ｍｌ邋ＬＰＳ逡逑共培養(yǎng)的最佳刺激濃度，２－Ｄ為ＥＰ與ｌＯＯ＾ｉｇ／ｍｌ邋ＬＰＳ共培養(yǎng)的最佳刺激濃度）逡逑２ＬＰＳ、ＲＰＴＳ、ＥＰ最佳刺激濃度逡逑不同濃度ＬＰＳ刺激Ｃａｃｏ－２細胞ＭＴＴ檢測顯示，隨著濃度梯度遞增ＯＤ值逡逑遞減，，１００ｐｇ／ｍｌ邋ＬＰＳ下降至空白對照組ＯＤ值一半左右，此濃度下Ｃａｃｏ－２細胞逡逑生長活性明顯受限，倒置顯微鏡觀察可見細胞數(shù)目顯著減少，部分區(qū)域有缺失空逡逑洞形成，漂浮細胞多，細胞形態(tài)不規(guī)則，折光性減弱。即ＬＰＳ最佳刺激濃度為逡逑１０0Ｈｇ／ｍｌ。見圖邋２－Ｂ。逡逑不同濃度ＲＰＴＳ與］ＯＯｐｇ／ｍｌ邋ＬＰＳ共培養(yǎng)ＭＴＴ檢測顯示，Ｏ．ｌ＾ｇ／ｍｌ和ｌｐｇ／ｍｌ逡逑濃度下，ＯＤ值升高。當ＲＰＴＳ＾１０（ｉｇ／ｍｌ時，ＯＤ值隨濃度升高逐漸下降，且低逡逑于１００ｐｇ／ｍｌ邋ＬＰＳ干預組ＯＤ值。即ＲＰＴＳ與ｌＯＯ＾ｇ／ｍ丨ＬＰＳ共培養(yǎng)的最佳刺激濃逡逑度為ｌｐｇ／ｍｌ。見圖２－Ｃ。逡逑
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R459.7

【參考文獻】

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本文編號：2647411