【摘要】：目的:研究過度自噬(Excessive autophagy)對白介素-33(Interleukin-33,IL-33)在急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)中促炎作用的調(diào)控作用。方法:1.收集正常健康對照者和臨床ARDS患者的血漿標(biāo)本,用ELISA的方法檢測其中IL-33的表達量,用細胞因子磁珠分選法檢測其中TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6和IL-10表達量。2.將20只雄性C57BL/6 WT小鼠隨機分成4組,分別是空白對照組(N組),脂多糖處理組(LPS組)、脂多糖+雷帕霉素預(yù)處理組(RAPA組)、脂多糖+3-甲基腺嘌呤預(yù)處理組(3-MA組),n=5/組。采用氣管滴注LPS的方式來制備急性肺損傷模型。在LPS組小鼠氣管滴注含LPS的PBS制備肺損傷模型。在手術(shù)前30分鐘,按體重比例給予RAPA組小鼠腹腔注射雷帕霉素4mg/kg,按體重比例給予3-MA組小鼠腹腔注射3-甲基腺嘌呤15mg/kg。于術(shù)后24小時觀察小鼠的一般情況;取小鼠血液、肺組織及肺泡灌洗液標(biāo)本;HE染色并在顯微鏡下觀察記錄其形態(tài)學(xué)變化,評估小鼠肺組織的損傷程度;免疫組化與qRT-PCR檢測小鼠肺組織中IL-33蛋白和mRNA的表達情況;免疫熒光及qRT-PCR檢測小鼠肺組織中NF-κB的表達情況;western-blot檢測小鼠肺組織中LC3和P62表達情況;ELISA方法檢測小鼠血清與肺泡灌洗液中IL-33表達,細胞因子磁珠分選方法檢測CXCL-1、TNF-α、IL-10、IL-13、IL-17A、IL-4、IL-6和CXCL-5水平的變化。結(jié)果:1.人血漿IL-33水平及其與其它細胞因子相關(guān)性ARDS患者血漿IL-33水平高于健康對照組(P0.0001);相關(guān)性分析顯示,ARDS患者血漿中IL-33與TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-6呈正相關(guān),與IL-10呈負相關(guān)。2.小鼠肺組織病理改變光鏡下觀察經(jīng)HE染色的肺組織,LPS組、RAPA組和3-MA組小鼠肺組織均可見明顯水腫、肺泡壁廣泛增厚、肺泡塌陷、肺泡內(nèi)出血和大量炎癥細胞浸潤。其中,3-MA組小鼠肺組織上述病理改變較LPS組明顯減輕,RAPA組小鼠肺組織上述病理改變較LPS組加重,N組未見明顯的肺損傷及炎癥表現(xiàn)。3.小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-33水平變化與空白對照組相比,LPS組、RAPA組和3-MA組小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-33的水平均發(fā)生了不同程度的變化。與LPS組相比,在經(jīng)過RAPA預(yù)處理后,小鼠血清及肺泡灌洗液當(dāng)中IL-33的水平有所增加(P0.0001,P0.0001),經(jīng)過3-MA預(yù)處理后,血清及肺泡灌洗液中IL-33水平稍增加,但低于LPS組水平(P0.05,P0.05)。4.小鼠肺組織中IL-33蛋白的表達與對照小鼠相比,LPS組、RAPA組及3-MA組小鼠肺組織中IL-33均有一定程度的增加。與LPS組相比,經(jīng)過RAPA預(yù)處理之后的RAPA組小鼠肺組織中的IL-33蛋白水平增加,經(jīng)過3-MA預(yù)處理之后的3-MA組小鼠肺組織中IL-33蛋白水平降低。5.小鼠肺組織中IL-33 mRNA的表達qRT-PCR數(shù)據(jù)顯示,LPS組小鼠肺中IL-33 mRNA升高,3-MA組中mRNA的表達低于LPS組(P0.001)。RAPA組肺組織中IL-33mRNA,高于LPS組(P0.05)。6.小鼠血清和肺泡灌洗液中多種細胞因子水平的變化RAPA組小鼠血清以及肺泡灌洗液中CXCL-1、CXCL-5、TNF-α、IL-17A和IL-6的表達量增加,其表達量高于LPS組(p0.001,p0.05;p0.05,p0.05;p0.01,p0.05;p0.0001,p0.001;p0.05,p0.001)。3-MA組血清以及肺泡灌洗液中CXCL-1、CXCL-5、TNF-α、IL-17A、IL-6的表達量相對于LPS組有所下降(P0.0001,p0.01;p0.0001,p0.0001;p0.0001,p0.01;p0.001,p0.001;p0.05,p0.01)。RAPA組小鼠血清以及肺泡灌洗液中IL-10的表達量低于LPS組(P0.05,p0.0001),3-MA組小鼠血清以及肺泡灌洗液中IL-10的表達量高于LPS組(P0.01,p0.05)。LPS組、RAPA組、3-MA組小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-4和IL-13表達量無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。7.小鼠肺組織LC3-Ⅱ和P62的表達量變化與正常對照組相比,LPS組小鼠肺組織中LC3B-Ⅱ的表達量增加,LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值增加。RAPA組小鼠肺組織中LC3-Ⅱ的表達量高于LPS組,LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值增加。3-MA組小鼠肺組織中LC3-Ⅱ的表達量低于LPS組,LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值降低。RAPA組小鼠肺組織中P62的表達量低于LPS組,P62/actin比值降低,3-MA組小鼠肺組織中P62表達量高于LPS組,P62/actin比值升高。8.小鼠肺組織中NF-κB(P65)核轉(zhuǎn)位變化氣道滴注LPS之后小鼠肺組織NF-κB(P65)的核轉(zhuǎn)位增加,LPS組的NF-κB(P65)的核轉(zhuǎn)位高于正常組。與LPS組相比,RAPA組NF-κB(P65)的核轉(zhuǎn)位水平增加。在3-MA組的NF-κB(P65)的核轉(zhuǎn)位稍有增加,但與LPS組相比,其核轉(zhuǎn)位水平較低。結(jié)論:過度自噬可影響小鼠急性肺損傷模型失控性炎癥進程。過度加強的自噬能夠加重小鼠肺部炎癥,抑制自噬能減輕小鼠肺部炎癥;過度自噬能調(diào)控小鼠急性肺損傷模型中IL-33的表達,其與NF-κB(P65)表達可能相關(guān)。
【圖文】：

見圖 1.1-C）、IL-2（r=0.7500，p<0.001，見圖1.1-D）、IL-6（r=0.6373，p<0.01，見圖 1.1-E）呈正相關(guān)，而與 IL-10（r=0.4975，p<0.05，見圖 1.1-F）呈負相關(guān)。1.1-A 1.1-B1.1-C 1.1-D1.1-E 1.1-F圖 1.1 患者血清 IL-33 表達及其與其他細胞因子相關(guān)性分析Fig 1.1 IL-33 and Correlation between serum IL-33 and other cytokine

圖 2.2 小鼠肺組織 LC3 和 P62 蛋白表達Fig 2.2 protein of LC3 and p62 in mouse lung.3 肺組織 HE 染色取空白對照組小鼠以及實驗組小鼠肺組織進行 HE 染色，觀察小鼠肺組織理改變，結(jié)果顯示：氣道滴注 LPS 之后，小鼠肺組織出現(xiàn)明顯病理學(xué)改肺泡充血，出血，肺泡間隔增厚，肺透明膜形成，并伴有大量炎癥細胞浸對照組小鼠肺組織未見明顯肺損傷及相關(guān)病理學(xué)改變，與 LPS 組相比，，R損傷評分明顯增高，而 3-MA 組小鼠肺損傷評分下降。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R563.8

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本文編號：2640330