【摘要】：目的:百草枯(paraqut,PQ)是一種非選擇性高效觸殺型有機雜環(huán)類除草劑,又名克無蹤,目前在全世界范圍內(nèi)廣泛應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。其具有高效能、土地殘留量少,對環(huán)境無污染等優(yōu)點,但百草枯對人和哺乳動物有劇毒。肺臟是百草枯中毒的主要靶器官,主要表現(xiàn)為早期的急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(acute lung injury/acute respiratory distress syndrome,ALI/ARDS),晚期的肺間質纖維化,被稱為“百草枯肺”。早期的急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合癥是百草枯中毒的主要死亡原因。目前臨床治療仍采取對癥支持方法,無特效解毒劑,療效甚微。因此,如何修復百草枯中毒所致急性肺損傷(paraqut-induced acute lung injury,PQ-ALI)是臨床關注的重點。干細胞移植是目前修復學的前沿研究,特別是成體干細胞具有取材方便、不涉及倫理等優(yōu)點,在近年的研究中取得了突破性進展,但在急性肺損傷的研究中仍處于起步階段。內(nèi)皮祖細胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)是成體干細胞的一種,能夠分化成血管內(nèi)皮細胞是其重要的潛能之一,在一些誘導因子的刺激下能增殖分化成為血管內(nèi)皮細胞,但尚未表達成熟血管內(nèi)皮細胞表型,是血管內(nèi)皮細胞的前體細胞,不僅在胚胎時期的血管發(fā)生及出生后的血管新生中發(fā)揮重要作用,而且在機體和各個器官遭受損傷后能夠對損傷的血管進行再生和修復。廣泛的內(nèi)皮受損為百草枯中毒所致急性肺損傷早期階段的特征性改變之一,內(nèi)皮祖細胞具有潛在的內(nèi)皮修復以及免疫調節(jié)功能,可能成為治療百草枯中毒急性肺損傷的有效手段。本實驗應用密度梯度離心聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)外周血內(nèi)皮祖細胞,經(jīng)典的腹腔注射法建立PQ-ALI模型,旨在探討內(nèi)皮祖細胞移植對PQ-ALI的生物學作用并進一步探討其相關機制,為百草枯中毒尋找潛在的有效治療途徑提供理論基礎和線索。研究方法:1、內(nèi)皮祖細胞移植對百草枯中毒所致急性肺損傷生物學作用的研究采用密度梯度離心聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)小鼠外周血內(nèi)皮祖細胞,并從形態(tài)學及細胞表面分子標記物兩個方面鑒定所提取細胞,為后期移植提供供體細胞。腹腔注射法建立PQ-ALI模型,建模成功后小鼠分為四組:Control組、EPC對照組、PQ組、EPC+PQ組,每組12只,移植后48小時處死小鼠并取肺組織,檢測肺組織W/D比、肺損傷評分、ELISA法測肺組織勻漿中TNF-α、IL-6和IL-10水平、試劑盒檢測肺組織MDA及SOD水平,探討內(nèi)皮祖細胞移植對PQ-ALI的生物學作用。2、內(nèi)皮祖細胞移植通過Notch-Nrf2軸治療百草枯中毒所致急性肺損傷的研究本部分實驗擬探討內(nèi)皮祖細胞移植修復PQ-ALI的機制,采用第一部分實驗中的內(nèi)皮祖細胞為供體細胞,將小鼠分為四組,每組12只,分別為:Control組、EPC對照組、PQ組、EPC+PQ組,移植后48小時處死小鼠取肺組織,應用qRT-PCR檢測Notch通路及Nrf2通路mRNA水平,Western-blot法檢測Notch通路及Nrf2通路蛋白表達情況。后進一步在體內(nèi)對Notch信號通路在RNA水平進行干擾,實驗中小鼠分為四組:PQ組、PQ+EPCs組、PQ+EPCs+si-control組、PQ+EPCs+si-notch組,48小時后取肺組織檢測Notch-Nrf2軸mRNA及蛋白表達水平,并同時檢測肺組織W/D比、肺損傷評分及炎癥因子表達等同第一部分實驗中的肺損傷相關指標。3、miR-141-3p在內(nèi)皮祖細胞移植治療百草枯中毒所致急性肺損傷中發(fā)揮的作用及其相關機制探討本部分實驗旨在更進一步探討內(nèi)皮祖細胞治療PQ-ALI的上游有關microRNA的調節(jié)機制。實驗中首先取48只小鼠,建立PQ-ALI模型,分成四組:Control組、EPCs組、PQ組、EPC+PQ組,48小時后取肺組織,qRT-PCR法檢測肺組織中miR-200a-3p、miR-21、miR-141-3p及miR-153水平,確定miR-141-3p為本實驗的研究對象,為排除動物實驗多種因素干擾,研究中更進一步在PQ處理的MLE-12中探討miR-141-3p對Notch-Nrf2軸的調控作用,應用lipofectamine2000將miR-141-3pminic、Pre-NC以及miR-141-3pinhibitor轉染入MLE-12細胞中,應用qRT-PCR以及Western-blot法檢測相關分子的mRAN及蛋白表達水平。最后在體內(nèi)實驗中過表達miR-141-3p,探討miR-141-3p在PQ-ALI中的作用。結果:1.密度梯度離心聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法成功分離培養(yǎng)出小鼠外周血內(nèi)皮祖細胞,細胞培養(yǎng)一周后成典型的鋪路石樣改變,流式細胞儀檢測細胞表面分子標記物為:CD31+CD34+Flk-1+CD45-CD133-。2.EPCs移植后小鼠肺組織W/D下降;肺損傷評分下降;肺組織促炎因子TNF-α、IL-6水平下降,抑炎因子IL-10水平升高;肺組織MDA水平下降;肺組織SOD水平升高。3.PQ-ALI時肺組織Notch-1及其下游靶基因Hers-1mRNA及蛋白表達水平受到抑制,EPCs移植后可逆轉。PQ-ALI時肺組織Nrf2及其下游靶基因Hmox1及Txnrd1mRNA及蛋白表達水平受到抑制,EPCs移植后可逆轉。4.體內(nèi)阻斷Notch-1后小鼠肺組織小鼠肺組織W/D上升;肺損傷評分上升;肺組織促炎因子TNF-α、IL-6水平升高,抑炎因子IL-10水平降低;肺組織MDA水平上升;肺組織SOD水平下降;肺組織Nrf2及其下游靶基因Hmox1及Txnrd1 mRNA及蛋白表達水平下降。5.PQ-ALI時,miR-200a-3p、miR-21表達下降,miR-141-3p及miR-153表達升高,EPCs移植后miR-141-3p水平明顯下降,miR-200a-3p、miR-21和miR-153水平無明顯變化,EPCs移植修復PQ-ALI與miR-141-3p相關。6.應用細胞轉染的方法上調MLE-12細胞中miR-141-3p水平后Notch-1及其下游靶基因Hesr-1的mRNA及蛋白表達水平下降。7.PQ處理后,MLE-12細胞中Notch-Nrf2軸相關分子的表達水平下降,基因敲除miR-141-3p后可逆轉PQ對Notch-Nrf2軸的抑制效應。8.PQ條件下,基因敲除miR-141-3p同時轉染si-notch后,Nrf2及其下游分子表達受抑制。9.體內(nèi)過表達miR-141-3p后,EPCs移植對PQ-ALI抗水腫、抗炎、抗氧化等的保護作用消失,同時Notch信號通路蛋白水平表達受抑制。結論:1.密度梯度離心聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法可以成功分離培養(yǎng)外周血內(nèi)皮祖細胞。2.內(nèi)皮祖細胞移植對百草枯誘導的急性肺損傷具有保護作用。3.內(nèi)皮祖細胞移植通過減輕肺水腫、降低氧化應激反應以及調節(jié)炎癥因子的表達等方面對PQ-ALI發(fā)揮保護作用。4.Notch-1及Nrf2通路在PQ-ALI中發(fā)揮重要作用,內(nèi)皮祖細胞移植通過Notch-Nrf2軸治療PQ-ALI。5.miR-141-3p與EPCs移植對PQ-ALI的保護作用相關。6.PQ通過上調miR-141-3p表達水平對Notch-Nrf2軸發(fā)揮抑制性調控作用。7.EPCs移植通過下調miR-141-3p的表達水平,從而促進Notch-Nrf2軸信號分子的表達發(fā)揮抗水腫、抗炎、抗氧化等保護作用。
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中國醫(yī)科大學博士學位論文3.3 EPCs 歸巢因子表達情況在正常對照組和 EPCs 對照組中，VEGF、CXCR4 和 SDF-1mRNA 均無明顯變化，兩組對比無差異（P>0.05）；PQ 條件下歸巢因子 VEGFmRNA 明顯增加，與對照組比差異顯著（P<0.05），EPCs 移植后可使小鼠肺組織 VEGFmRNA 進一步增加，，與 PQ 損傷組對比差異顯著（P<0.05）；EPCs 歸巢因子 CXCR4 與 SDF-1mRNA 在PQ 損傷組顯著降低，與對照組對比差異顯著（P<0.05），EPCs 移植組 CXCR4 與SDF-1mRNA 明顯升高，與 PQ 損傷組對比差異顯著（P<0.05），可見，EPCs 移植后可明顯歸巢至受損肺組織發(fā)揮作用，如圖 3.3。

15組織病理學表現(xiàn)（A、小鼠肺組織 HE 染色后光學顯微鏡下表現(xiàn)；分情況**P<0.05vs Control；##P<0.05 vs PQ）織濕/干比（W/D） 3.4.2 所示：正常對照組與 EPCs 對照組相比小鼠肺 W/D 比差異（P>0.05）；PQ 損傷組小鼠肺組織 W/D 明顯增加，與（P<0.05）；尾靜脈移植 EPCs 后可以明顯降低小鼠肺組織比差異顯著（P<0.05），EPCs 移植后可逆轉 PQ 所致肺組織 W
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R595.4

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 杜宇;牟奕;;三種方法對急性百草枯中毒嚴重程度和預后評估價值的比較[J];中南大學學報(醫(yī)學版);2013年07期

2 汪鴻;常立文;盧紅艷;李文斌;蔡成;黃光焰;陳燕;;γ泌肽酶抑制劑對胎鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞Notch信號通路的影響[J];實用兒科臨床雜志;2008年06期

本文編號：2639351