【摘要】：目的:百草枯(paraqut,PQ)是一種非選擇性高效觸殺型有機(jī)雜環(huán)類(lèi)除草劑,又名克無(wú)蹤,目前在全世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。其具有高效能、土地殘留量少,對(duì)環(huán)境無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn),但百草枯對(duì)人和哺乳動(dòng)物有劇毒。肺臟是百草枯中毒的主要靶器官,主要表現(xiàn)為早期的急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(acute lung injury/acute respiratory distress syndrome,ALI/ARDS),晚期的肺間質(zhì)纖維化,被稱(chēng)為“百草枯肺”。早期的急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合癥是百草枯中毒的主要死亡原因。目前臨床治療仍采取對(duì)癥支持方法,無(wú)特效解毒劑,療效甚微。因此,如何修復(fù)百草枯中毒所致急性肺損傷(paraqut-induced acute lung injury,PQ-ALI)是臨床關(guān)注的重點(diǎn)。干細(xì)胞移植是目前修復(fù)學(xué)的前沿研究,特別是成體干細(xì)胞具有取材方便、不涉及倫理等優(yōu)點(diǎn),在近年的研究中取得了突破性進(jìn)展,但在急性肺損傷的研究中仍處于起步階段。內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)是成體干細(xì)胞的一種,能夠分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞是其重要的潛能之一,在一些誘導(dǎo)因子的刺激下能增殖分化成為血管內(nèi)皮細(xì)胞,但尚未表達(dá)成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞表型,是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,不僅在胚胎時(shí)期的血管發(fā)生及出生后的血管新生中發(fā)揮重要作用,而且在機(jī)體和各個(gè)器官遭受損傷后能夠?qū)p傷的血管進(jìn)行再生和修復(fù)。廣泛的內(nèi)皮受損為百草枯中毒所致急性肺損傷早期階段的特征性改變之一,內(nèi)皮祖細(xì)胞具有潛在的內(nèi)皮修復(fù)以及免疫調(diào)節(jié)功能,可能成為治療百草枯中毒急性肺損傷的有效手段。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用密度梯度離心聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞,經(jīng)典的腹腔注射法建立PQ-ALI模型,旨在探討內(nèi)皮祖細(xì)胞移植對(duì)PQ-ALI的生物學(xué)作用并進(jìn)一步探討其相關(guān)機(jī)制,為百草枯中毒尋找潛在的有效治療途徑提供理論基礎(chǔ)和線(xiàn)索。研究方法:1、內(nèi)皮祖細(xì)胞移植對(duì)百草枯中毒所致急性肺損傷生物學(xué)作用的研究采用密度梯度離心聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)小鼠外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞,并從形態(tài)學(xué)及細(xì)胞表面分子標(biāo)記物兩個(gè)方面鑒定所提取細(xì)胞,為后期移植提供供體細(xì)胞。腹腔注射法建立PQ-ALI模型,建模成功后小鼠分為四組:Control組、EPC對(duì)照組、PQ組、EPC+PQ組,每組12只,移植后48小時(shí)處死小鼠并取肺組織,檢測(cè)肺組織W/D比、肺損傷評(píng)分、ELISA法測(cè)肺組織勻漿中TNF-α、IL-6和IL-10水平、試劑盒檢測(cè)肺組織MDA及SOD水平,探討內(nèi)皮祖細(xì)胞移植對(duì)PQ-ALI的生物學(xué)作用。2、內(nèi)皮祖細(xì)胞移植通過(guò)Notch-Nrf2軸治療百草枯中毒所致急性肺損傷的研究本部分實(shí)驗(yàn)擬探討內(nèi)皮祖細(xì)胞移植修復(fù)PQ-ALI的機(jī)制,采用第一部分實(shí)驗(yàn)中的內(nèi)皮祖細(xì)胞為供體細(xì)胞,將小鼠分為四組,每組12只,分別為:Control組、EPC對(duì)照組、PQ組、EPC+PQ組,移植后48小時(shí)處死小鼠取肺組織,應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)Notch通路及Nrf2通路mRNA水平,Western-blot法檢測(cè)Notch通路及Nrf2通路蛋白表達(dá)情況。后進(jìn)一步在體內(nèi)對(duì)Notch信號(hào)通路在RNA水平進(jìn)行干擾,實(shí)驗(yàn)中小鼠分為四組:PQ組、PQ+EPCs組、PQ+EPCs+si-control組、PQ+EPCs+si-notch組,48小時(shí)后取肺組織檢測(cè)Notch-Nrf2軸mRNA及蛋白表達(dá)水平,并同時(shí)檢測(cè)肺組織W/D比、肺損傷評(píng)分及炎癥因子表達(dá)等同第一部分實(shí)驗(yàn)中的肺損傷相關(guān)指標(biāo)。3、miR-141-3p在內(nèi)皮祖細(xì)胞移植治療百草枯中毒所致急性肺損傷中發(fā)揮的作用及其相關(guān)機(jī)制探討本部分實(shí)驗(yàn)旨在更進(jìn)一步探討內(nèi)皮祖細(xì)胞治療PQ-ALI的上游有關(guān)microRNA的調(diào)節(jié)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)中首先取48只小鼠,建立PQ-ALI模型,分成四組:Control組、EPCs組、PQ組、EPC+PQ組,48小時(shí)后取肺組織,qRT-PCR法檢測(cè)肺組織中miR-200a-3p、miR-21、miR-141-3p及miR-153水平,確定miR-141-3p為本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象,為排除動(dòng)物實(shí)驗(yàn)多種因素干擾,研究中更進(jìn)一步在PQ處理的MLE-12中探討miR-141-3p對(duì)Notch-Nrf2軸的調(diào)控作用,應(yīng)用lipofectamine2000將miR-141-3pminic、Pre-NC以及miR-141-3pinhibitor轉(zhuǎn)染入MLE-12細(xì)胞中,應(yīng)用qRT-PCR以及Western-blot法檢測(cè)相關(guān)分子的mRAN及蛋白表達(dá)水平。最后在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中過(guò)表達(dá)miR-141-3p,探討miR-141-3p在PQ-ALI中的作用。結(jié)果:1.密度梯度離心聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法成功分離培養(yǎng)出小鼠外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞,細(xì)胞培養(yǎng)一周后成典型的鋪路石樣改變,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子標(biāo)記物為:CD31+CD34+Flk-1+CD45-CD133-。2.EPCs移植后小鼠肺組織W/D下降;肺損傷評(píng)分下降;肺組織促炎因子TNF-α、IL-6水平下降,抑炎因子IL-10水平升高;肺組織MDA水平下降;肺組織SOD水平升高。3.PQ-ALI時(shí)肺組織Notch-1及其下游靶基因Hers-1mRNA及蛋白表達(dá)水平受到抑制,EPCs移植后可逆轉(zhuǎn)。PQ-ALI時(shí)肺組織Nrf2及其下游靶基因Hmox1及Txnrd1mRNA及蛋白表達(dá)水平受到抑制,EPCs移植后可逆轉(zhuǎn)。4.體內(nèi)阻斷Notch-1后小鼠肺組織小鼠肺組織W/D上升;肺損傷評(píng)分上升;肺組織促炎因子TNF-α、IL-6水平升高,抑炎因子IL-10水平降低;肺組織MDA水平上升;肺組織SOD水平下降;肺組織Nrf2及其下游靶基因Hmox1及Txnrd1 mRNA及蛋白表達(dá)水平下降。5.PQ-ALI時(shí),miR-200a-3p、miR-21表達(dá)下降,miR-141-3p及miR-153表達(dá)升高,EPCs移植后miR-141-3p水平明顯下降,miR-200a-3p、miR-21和miR-153水平無(wú)明顯變化,EPCs移植修復(fù)PQ-ALI與miR-141-3p相關(guān)。6.應(yīng)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)MLE-12細(xì)胞中miR-141-3p水平后Notch-1及其下游靶基因Hesr-1的mRNA及蛋白表達(dá)水平下降。7.PQ處理后,MLE-12細(xì)胞中Notch-Nrf2軸相關(guān)分子的表達(dá)水平下降,基因敲除miR-141-3p后可逆轉(zhuǎn)PQ對(duì)Notch-Nrf2軸的抑制效應(yīng)。8.PQ條件下,基因敲除miR-141-3p同時(shí)轉(zhuǎn)染si-notch后,Nrf2及其下游分子表達(dá)受抑制。9.體內(nèi)過(guò)表達(dá)miR-141-3p后,EPCs移植對(duì)PQ-ALI抗水腫、抗炎、抗氧化等的保護(hù)作用消失,同時(shí)Notch信號(hào)通路蛋白水平表達(dá)受抑制。結(jié)論:1.密度梯度離心聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法可以成功分離培養(yǎng)外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞。2.內(nèi)皮祖細(xì)胞移植對(duì)百草枯誘導(dǎo)的急性肺損傷具有保護(hù)作用。3.內(nèi)皮祖細(xì)胞移植通過(guò)減輕肺水腫、降低氧化應(yīng)激反應(yīng)以及調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)等方面對(duì)PQ-ALI發(fā)揮保護(hù)作用。4.Notch-1及Nrf2通路在PQ-ALI中發(fā)揮重要作用,內(nèi)皮祖細(xì)胞移植通過(guò)Notch-Nrf2軸治療PQ-ALI。5.miR-141-3p與EPCs移植對(duì)PQ-ALI的保護(hù)作用相關(guān)。6.PQ通過(guò)上調(diào)miR-141-3p表達(dá)水平對(duì)Notch-Nrf2軸發(fā)揮抑制性調(diào)控作用。7.EPCs移植通過(guò)下調(diào)miR-141-3p的表達(dá)水平,從而促進(jìn)Notch-Nrf2軸信號(hào)分子的表達(dá)發(fā)揮抗水腫、抗炎、抗氧化等保護(hù)作用。
【圖文】：

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3.3 EPCs 歸巢因子表達(dá)情況在正常對(duì)照組和 EPCs 對(duì)照組中，VEGF、CXCR4 和 SDF-1mRNA 均無(wú)明顯變化，兩組對(duì)比無(wú)差異（P>0.05）；PQ 條件下歸巢因子 VEGFmRNA 明顯增加，與對(duì)照組比差異顯著（P<0.05），EPCs 移植后可使小鼠肺組織 VEGFmRNA 進(jìn)一步增加，，與 PQ 損傷組對(duì)比差異顯著（P<0.05）；EPCs 歸巢因子 CXCR4 與 SDF-1mRNA 在PQ 損傷組顯著降低，與對(duì)照組對(duì)比差異顯著（P<0.05），EPCs 移植組 CXCR4 與SDF-1mRNA 明顯升高，與 PQ 損傷組對(duì)比差異顯著（P<0.05），可見(jiàn)，EPCs 移植后可明顯歸巢至受損肺組織發(fā)揮作用，如圖 3.3。

15組織病理學(xué)表現(xiàn)（A、小鼠肺組織 HE 染色后光學(xué)顯微鏡下表現(xiàn)；分情況**P<0.05vs Control；##P<0.05 vs PQ）織濕/干比（W/D） 3.4.2 所示：正常對(duì)照組與 EPCs 對(duì)照組相比小鼠肺 W/D 比差異（P>0.05）；PQ 損傷組小鼠肺組織 W/D 明顯增加，與（P<0.05）；尾靜脈移植 EPCs 后可以明顯降低小鼠肺組織比差異顯著（P<0.05），EPCs 移植后可逆轉(zhuǎn) PQ 所致肺組織 W
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R595.4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 杜宇;牟奕;;三種方法對(duì)急性百草枯中毒嚴(yán)重程度和預(yù)后評(píng)估價(jià)值的比較[J];中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2013年07期

2 汪鴻;常立文;盧紅艷;李文斌;蔡成;黃光焰;陳燕;;γ泌肽酶抑制劑對(duì)胎鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞Notch信號(hào)通路的影響[J];實(shí)用兒科臨床雜志;2008年06期

本文編號(hào)：2639351