【摘要】：研究背景和目的:慢性創(chuàng)面是臨床治療頗為棘手的疾病,常見于與糖尿病足、靜脈性潰瘍、褥瘡及深度創(chuàng)傷等疾病。目前,臨床上針對慢性創(chuàng)面仍缺乏有效的治療方法,其修復(fù)難點(diǎn)在于新生血管較正常創(chuàng)面少,創(chuàng)面局部血液供應(yīng)不足,炎癥因素持續(xù)存在等。隨著干細(xì)胞技術(shù)的不斷突破,ADSCs因較其它成體干細(xì)胞更易獲取、儲量豐富、并發(fā)癥小、較少涉及倫理問題,再次注射后可以分泌多種促進(jìn)血管新生生長因子,被認(rèn)為是目前最適宜的創(chuàng)面修復(fù)干細(xì)胞。然而一方面直接將干細(xì)胞注射到病變部位,細(xì)胞存活率較低。其次SVF/ADSCs的制備過程較復(fù)雜,耗時(shí)耗力耗財(cái),臨床上廣泛使用可行性不強(qiáng)。再者SVF/ADSCs提取過程中添加的膠原酶及培養(yǎng)過程中添加的異種血清都可能對ADSCs造成污染,引起機(jī)體免疫排斥反應(yīng)。因此,尋找到一種高效、經(jīng)濟(jì)、安全的方法在臨床治療研究領(lǐng)域處理以上問題顯得尤為重要。SVF-gel是一脂肪細(xì)胞破壞,并經(jīng)過高速離心析出大量的油脂,得到富含有脂肪干細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的復(fù)合物。ECM可以為ADSCs提供細(xì)胞外支架,保護(hù)脂肪干細(xì)胞免遭巨噬細(xì)胞的吞噬,使其能更好的發(fā)揮再生能力。于是我們猜測SVF-gel相比與單純的SVF懸液,有更佳的促進(jìn)創(chuàng)面愈合的效果。本課題擬將SVF-gel局部移植到慢性創(chuàng)面模型,來觀察和評估其對慢性創(chuàng)面治療的效果。方法:首先制備SVF-gel模型,并對其是否含有脂肪干細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證。其次,我們建立糖尿病鼠慢性創(chuàng)面模型,同時(shí)將SVF-gel和SVF懸液局部移植到大鼠的創(chuàng)面上,拍照觀察創(chuàng)面愈合情況并計(jì)算出每組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面愈合率。收集標(biāo)本,進(jìn)行HE染色,觀察各組創(chuàng)面組織病理學(xué)狀況,免疫組織化學(xué)染色計(jì)算各組創(chuàng)面新生血管的數(shù)量。western blotting分別檢測各組糖尿病大鼠第14d創(chuàng)面肉芽組織中VEGF蛋白表達(dá)情況。進(jìn)一步探究SVF-gel促進(jìn)創(chuàng)面再生的可能機(jī)制。結(jié)果:1.成功制備的SVF-gel是一種類似透明質(zhì)酸凝膠狀的物質(zhì),10ml的結(jié)構(gòu)脂肪可以得到大約1ml的SVF-gel,對SVF-gel進(jìn)行體外培養(yǎng),可以成功的培養(yǎng)出脂肪干細(xì)胞,并且這些脂肪干細(xì)胞仍具有成脂、成骨、成軟骨的多向分化的能力。2.創(chuàng)面愈合率比較:SVF-gel組在3d、7d、10d、14d的創(chuàng)面愈合率明顯優(yōu)于其他兩組。說明SVF-gel對慢性創(chuàng)面有更佳的促愈合效果。3.HE染色結(jié)果:第14d,對照組創(chuàng)面內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤和成纖維細(xì)胞,細(xì)胞排列紊,新生血管少,肉芽組織結(jié)構(gòu)疏松,再上皮化不完整。SVF-gel組與SVF懸液組相比,炎癥細(xì)胞浸潤減少,真皮毛細(xì)血管數(shù)量明顯增多,再上皮化程度明顯,肉芽組織結(jié)構(gòu)致密。SVF懸液組與對照組相比,炎癥細(xì)胞浸潤減少,較多的膠原纖維及毛細(xì)血管,再上皮化較完整,但不及SVF_gel組。4.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果:治療后10d,3組創(chuàng)面肉芽組織內(nèi)均有垂直于創(chuàng)面的新血管生成。SVF-gel、SVF懸液兩組新生血管數(shù)量多于生理鹽水對照組,部分新生血管尚無明顯的管腔結(jié)構(gòu),血管斷層僅有單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞。14d后,創(chuàng)面內(nèi)血管的數(shù)量均較10d明顯增加。SVF-gel組、SVF懸液組創(chuàng)面內(nèi)均可見較多具有成熟管腔的新生血管,而生理鹽水組較少。5.western blotting檢測10d各組創(chuàng)面組織內(nèi)VEGF蛋白的表達(dá)情況:SVF-gel組VEGF蛋白表達(dá)較SVF懸液組、對照組明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),VEGF蛋白在SVF懸液的表達(dá)量也明顯高于對照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)結(jié)論:SVF-gel是一種新型的脂肪來源可注射產(chǎn)物,使用簡單的物理方法便可從脂肪抽吸物中獲得高度濃縮的脂肪干細(xì)胞和近似生理狀態(tài)下的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。我們將SVF-gel應(yīng)用到大鼠的慢性創(chuàng)面中,與單純的SVF懸液相比,其有更佳的促進(jìn)創(chuàng)面愈合的效果。主要是通過分泌更多VEGF,誘導(dǎo)慢性創(chuàng)面中新生血管的形成,同時(shí)其也可調(diào)控難愈合創(chuàng)面內(nèi)炎癥反應(yīng),加速再上皮化的形成。
【圖文】：

gel 的實(shí)物獲取結(jié)果man 脂肪在兩個(gè)注射器之間來回的對推，先變成乳糜狀的納t），，然后經(jīng)過高速離心后析出大量的油脂，變成了類似透明質(zhì)質(zhì)即 SVF-gel。10ml 的結(jié)構(gòu)脂肪大約可得到 1ml 的 SVF-gel。如下Coleman 脂肪 Nanofat

3.2 SVF-gel 的細(xì)胞體外培養(yǎng)剛從 SVF-gel 分離培養(yǎng)的干細(xì)胞成透明的圓滴狀，漂浮在培養(yǎng)基中。2細(xì)胞大多數(shù)能完全貼壁，變成菱形或者多角形。如圖 1-2：貼壁的 ADSCs（200×）圖 1-23.3 SVF-gel 中提取的原代 ADSC 三系分化的結(jié)果將從 SVF-gel 分離培養(yǎng)的細(xì)胞，進(jìn)行成脂、成骨、成軟骨三系誘導(dǎo)分下圖為 ADSCs 三系分化的結(jié)果：
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R587.2;R641

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2631592