發(fā)布時(shí)間：2020-04-17 17:25

【摘要】：研究目的:創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)是人類(lèi)21世紀(jì)致死致殘的重要因素,其主要機(jī)制與腦創(chuàng)傷后的神經(jīng)元凋亡以及炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在細(xì)胞凋亡以及免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,但其與顱腦創(chuàng)傷的關(guān)系尚不明確。本課題組將在既往研究的基礎(chǔ)上探索顱腦創(chuàng)傷小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的變化規(guī)律,并通過(guò)�；切苋パ跄懰�(TUDCA)阻斷顱腦創(chuàng)傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,進(jìn)一步探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)元凋亡、免疫炎癥反應(yīng)以及血腦屏障破壞中的作用,為顱腦創(chuàng)傷提供新的治療靶點(diǎn)和理論依據(jù)。方法:1.通過(guò)采用電控腦挫傷打擊儀(eCCI)制作小鼠腦創(chuàng)傷模型。成年雄性C57/BL6小鼠被隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)和顱腦創(chuàng)傷組(TBI組)。TBI組小鼠又根據(jù)不同的處死取材時(shí)間分為顱腦創(chuàng)傷后12h、1D、3D、7D組。通過(guò)Western Blot技術(shù)和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)TBI小鼠不同時(shí)間腦組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)標(biāo)記物GRP78的變化規(guī)律。2.為了探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在顱腦創(chuàng)傷中的作用,我們通過(guò)腹腔注射TUDCA(500mg/kg)阻斷TBI小鼠的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為假手術(shù)組(Sham組),顱腦創(chuàng)傷組(TBI組)以及顱腦創(chuàng)傷+TUDCA(TBI+TUDCA組)。應(yīng)用Western Blot檢測(cè)p-PERK,PERK,p-eIF2a,eIF2a,ATF4的表達(dá)水平,評(píng)估TUDCA對(duì)TBI小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制作用;通過(guò)改良的神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分(mNSS評(píng)分)以及平衡木實(shí)驗(yàn)(Beam Balance實(shí)驗(yàn))評(píng)估內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與TBI小鼠神經(jīng)功能恢復(fù)之間的關(guān)系;應(yīng)用干濕重法評(píng)估TBI小鼠的腦組織水腫情況,通過(guò)伊文思藍(lán)滲漏(Evans Blue滲漏)法評(píng)估TBI小鼠血腦屏障的破壞程度,通過(guò)Western Blot技術(shù)檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1,Claudin5的表達(dá)水平,探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與TBI后血腦屏障破壞的的關(guān)系;應(yīng)用免疫熒光技術(shù)和ELISA試劑盒檢測(cè)TBI后小膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況以及IL-1β、TNFα、IL-6等炎癥因子釋放情況,探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與TBI后免疫炎癥反應(yīng)的關(guān)系;應(yīng)用TUNEL試劑盒檢測(cè)TBI小鼠神經(jīng)元的凋亡情況以及應(yīng)用Western Blot技術(shù)和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)TBI小鼠腦組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)性細(xì)胞凋亡蛋白Chop以及Caspase-12在神經(jīng)元中的表達(dá)情況,探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與TBI后神經(jīng)元細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。3.為了探索TUDCA的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制,我們首先通過(guò)Western Blot技術(shù)檢測(cè)顱腦創(chuàng)傷組小鼠TBI后12h、1D、3D、7D的Akt蛋白的變化規(guī)律。給予小鼠注射TUDCA后檢測(cè)不同組別小鼠腦組織Pten、p-Akt、Akt、Bax、Bcl-2的表達(dá)水平,探索TUDCA與Akt信號(hào)通路及其下游凋亡相關(guān)蛋白的關(guān)系。隨后我們通過(guò)給予TBI小鼠口服MK2206(60 mg/kg)以及側(cè)腦室注射siRNA-Akt來(lái)阻斷Akt基因的表達(dá),通過(guò)應(yīng)用改良的神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分(mNSS評(píng)分)以及平衡木實(shí)驗(yàn)(Beam balance實(shí)驗(yàn))檢測(cè)Akt信號(hào)通路被阻斷后TBI小鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)情況,通過(guò)應(yīng)用Western Blot技術(shù)和qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)Grp78,p-eIF2a,eIF2a,Bcl-2,Bax,CHOP,p-Akt,Akt,Pten以及Caspase-12的表達(dá)水平,進(jìn)一步探索TUDCA發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。結(jié)果:1.(1)TBI后,腦組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記物Grp78的表達(dá)水平從12h起開(kāi)始逐漸升高,并在TBI后3D達(dá)到高峰。(2)與Sham組相比,TBI小鼠腦組織神經(jīng)元中CHOP的表達(dá)水平也有顯著增加。2.(1)TUDCA可有效阻斷PERK-ATF4-CHOP信號(hào)通路的激活,有效抑制TBI后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平。(2)阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可顯著改善TBI小鼠的神經(jīng)功能預(yù)后。(3)阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以明顯緩解TBI小鼠的腦組織水腫,減輕血腦屏障滲漏,促進(jìn)TBI小鼠的血腦屏障修復(fù)。(4)阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可明顯降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)性細(xì)胞凋亡蛋白在神經(jīng)元中的表達(dá),減少神經(jīng)元凋亡。(5)阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可有效減少TBI后小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度激活以及炎癥因子的釋放,緩解免疫炎癥反應(yīng)。3.(1)p-Akt的表達(dá)水平則從TBI后12h開(kāi)始逐漸降低,并在TBI后的3D達(dá)到最低。(2)TUDCA可以在抑制Pten基因的表達(dá)的同時(shí)促進(jìn)Akt信號(hào)通路的激活,并通過(guò)調(diào)控下游凋亡蛋白的表達(dá)緩解TBI引發(fā)的腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡。(3)MK2206(60 mg/kg)以及siRNA-Akt均可以顯著抑制TUDCA對(duì)TBI小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用,進(jìn)一步驗(yàn)證TUDCA的保護(hù)作用是通過(guò)激活A(yù)kt信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。結(jié)論:1.TBI可引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)性細(xì)胞凋亡蛋白在神經(jīng)元中的表達(dá),且于傷后第3天達(dá)到高峰。2.阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可有效促進(jìn)TBI小鼠的血腦屏障修復(fù),促進(jìn)血管新生,減少血腦屏障滲漏。3.阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可有效緩解TBI小鼠的炎癥反應(yīng),減少神經(jīng)元凋亡,改善TBI小鼠預(yù)后。4.TUDCA可有效阻斷Pten基因的表達(dá),并促進(jìn)Akt信號(hào)通路的激活,通過(guò)調(diào)控下游Bax、Bcl-2等基因的表達(dá)改善TBI小鼠預(yù)后。5.Akt抑制劑可明顯阻斷TUDCA的神經(jīng)保護(hù)作用,提示TUDCA的神經(jīng)保護(hù)作用依賴(lài)Akt信號(hào)通路的激活來(lái)實(shí)現(xiàn)。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R651.15

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本文編號(hào)：2631109