【摘要】：研究目的:既往我們的研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)毒素急性肺損傷過程中存在著細胞器功能障礙,包括線粒體功能障礙、內(nèi)質網(wǎng)應激等。而作為內(nèi)質網(wǎng)和線粒體之間的重要結構,ERMC是多種疾病發(fā)生發(fā)展的重要作用因素,但內(nèi)毒素急性肺損傷過程中是否存在ERMC異常并不清楚。為此,本課題主要探討ERMC在內(nèi)毒素急性肺損傷發(fā)病機制中的作用。研究方法:為了驗證ERMC在內(nèi)毒素急性肺損傷中的作用和篩選其中發(fā)揮主要作用的蛋白分子,我們從動物模型和細胞模型兩個水平進行評估,具體分為以下三個部分:第一部分主要構建內(nèi)毒素急性肺損傷小鼠模型。首先我們分別比較BALB/c和C57BL/6兩種小鼠在接受不同劑量LPS(5、10和20mg/kg)尾靜脈注射后12小時內(nèi)兩種小鼠的生存率情況和肺組織損傷情況;另外,我們又觀察了不同給藥途徑對BALB/c小鼠生存率的影響。通過分析上述結果我們將C57BL/6小鼠作為構建內(nèi)毒素急性肺損傷的研究對象。C57BL/6小鼠尾靜脈注射LPS 15mg/kg,對照組小鼠予以等體積的生理鹽水作為對照,分別于LPS注射后1、4、8和12小時四個不同時點,觀察肺組織損傷評分、W/D、BALF中白蛋白含量、BALF和血清中TNF-α、IL-6、MDA含量和SOD活性的變化,通過比較上述不同時點的變化情況,我們來確定LPS作用于小鼠的最佳時點。第二部分主要觀察內(nèi)毒素急性肺損傷引起的ERMC的變化。通過透射電鏡觀察內(nèi)毒素急性肺損傷小鼠肺組織內(nèi)ERMC的變化,并比較ERMC組成分子的表達變化,從而篩選異常表達的蛋白分子;此外,通過檢測線粒體內(nèi)Ca~(2+)和ROS的變化、線粒體膜電位及線粒體RCR的變化以此反映ERMC異常所引起的功能改變。第三部分通過siRNA下調IP3R-1的表達水平,觀察其能否改善內(nèi)毒素攻擊細胞模型中線粒體功能及抑制ERMC形成,主要指標與動物實驗相同;除外之外,我們又檢測了線粒體途徑細胞凋亡相關蛋白的表達水平。研究結果:通過實驗一我們發(fā)現(xiàn),在相同LPS作用下,BALB/c小鼠12小時生存率均低于C57BL/6小鼠,差異均具有統(tǒng)計學意義,但兩種小鼠肺組織損傷程度相當;不同LPS給藥途徑對BALB/c小鼠的12小時生存率無明顯影響,由此我們確立了C57BL/6小鼠為構建內(nèi)毒素急性肺損傷的實驗動物。隨后,通過比較尾靜脈注射15mg/kg LPS后不同時點各指標的變化,我們發(fā)現(xiàn)LPS注射12h后肺組織損傷半定量評分最高,W/D和BALF中白蛋白最高,血清和BALF中TNF-α、IL-6和MDA水平最高,SOD活性最低。由此我們確定了內(nèi)毒素急性肺損傷模型中LPS給藥劑量為15mg/kg,作用時間為12h。由實驗二我們發(fā)現(xiàn),內(nèi)毒素急性肺損傷小鼠肺組織細胞內(nèi)ERMC形成增多,線粒體明顯腫脹、空泡化,單個視野內(nèi)線粒體數(shù)目減少而橫截面積顯著增加;肺組織勻漿中和ERMC中IP3R-1的表達水平明顯上調,Mfn-2的表達顯著下調,而其他ERMC組成分子如IP3R-2、PACS-2和Sig-1R表達無明顯變化;此外,線粒體功能學實驗發(fā)現(xiàn),線粒體RCR和線粒體膜電位明顯降低,線粒體內(nèi)Ca~(2+)含量和ROS含量升高明顯,差異均顯著。在實驗三中,我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素攻擊細胞模型中細胞內(nèi)同樣表現(xiàn)出線粒體腫脹、空泡化和線粒體嵴消失,ERMC形成增加,線粒體功能異常;而通過siRNA基因沉默IP3R-1能夠使內(nèi)毒素攻擊細胞模型內(nèi)線粒體腫脹程度減輕,ERMC形成顯著減低,提高線粒體膜電位和線粒體RCR水平,降低線粒體Ca~(2+)濃度,減少線粒體內(nèi)ROS的生成量,IP3R-1表達降低能夠明顯下調內(nèi)毒素攻擊細胞模型細胞內(nèi)Caspase-9、Caspase-3和Bax等與線粒體途徑細胞凋亡相關蛋白的表達水平,顯著上調Bcl-2的表達水平。研究結論:在內(nèi)毒素急性肺損傷過程中,小鼠肺組織細胞內(nèi)ERMC形成增加,且參與Ca~(2+)轉運的IP3R-1的表達明顯上調,進而導致線粒體內(nèi)鈣超載,進而導致線粒體功能異常,而下調細胞內(nèi)IP3R-1的表達水平能夠抑制內(nèi)毒素攻擊細胞模型中細胞內(nèi)ERMC的形成,從而改善線粒體功能,抑制細胞凋亡,發(fā)揮細胞保護作用,而Mfn-2在內(nèi)毒素急性肺損傷中ERMC中作用仍不明確,需要進一步研究。
【圖文】：

絎宦畚?圖 1、內(nèi)質網(wǎng)線粒體結構偶聯(lián)（ERMC）結構模式圖1、ERMC 異�？梢鹁�粒體鈣超載，導致線粒體功能障礙正常生理情況下，Ca2+主要儲存在內(nèi)質網(wǎng)中，當興奮時釋放到胞漿中形成鈣信號，引起廣泛的生理效應[35]。線粒體能夠攝取并儲存少量 Ca2+，Ca2+通過影響線粒體氧化呼吸鏈中幾類脫氫酶調節(jié)線粒體自身的代謝狀態(tài)[36]。研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+在一定濃度內(nèi)可以促進三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）合成，由 IP3R 介導釋放的 Ca2+參與線粒體能量代謝，如果敲除細胞 IP3R

天津醫(yī)科大學博士學位論文方便肺泡支氣管灌洗，將小鼠旋轉 180°，使小鼠的頭部分游離。8#靜脈留置針插入氣管內(nèi)，用 2-0 絲線結扎固定。ml 注射器吸取 500 μl PBS 緩沖液，抽取 500μl 空氣，將推注到氣管內(nèi)，小心反復抽取 3 次，將收集到的 BAL述收集好的 BALF 在 4℃、500 g 下離心 5 min，收集上白蛋白的含量。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R563.8

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本文編號：2597587