本文關(guān)鍵詞：缺氧微環(huán)境下微管相關(guān)蛋白4對(duì)人表皮細(xì)胞遷移能力影響及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景和目的 目前，在整個(gè)燒創(chuàng)傷領(lǐng)域，創(chuàng)面愈合是我們?cè)跓齽?chuàng)傷治療中遇到的基本問(wèn)題，而如何來(lái)促進(jìn)皮膚燒創(chuàng)傷后創(chuàng)面的修復(fù)是燒創(chuàng)傷治療的主要任務(wù)。燒創(chuàng)傷后的創(chuàng)面愈合是個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程[1]，它包含了各種細(xì)胞、各種因子以及在這些細(xì)胞和因子之間的錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系[2]，涉及到了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化等細(xì)胞生物學(xué)的多個(gè)方面，但在這些過(guò)程中主要包括兩個(gè)方面的內(nèi)容：肉芽組織的形成以及創(chuàng)面再上皮化，在創(chuàng)面再上皮化這個(gè)過(guò)程中，表皮細(xì)胞的遷移又被認(rèn)為是決定創(chuàng)面愈合的一個(gè)關(guān)鍵步驟，這也是目前國(guó)內(nèi)以及世界上創(chuàng)面愈合研究的焦點(diǎn)。目前的研究認(rèn)為，人皮膚在急性損傷后，如各種燒創(chuàng)傷會(huì)使創(chuàng)面處于一個(gè)暫時(shí)的缺氧狀態(tài)，這個(gè)缺氧微環(huán)境可以促進(jìn)人表皮細(xì)胞的遷移，來(lái)完成我們皮膚的創(chuàng)面愈合，在體外實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了缺氧微環(huán)境下表皮細(xì)胞的遷移能力會(huì)增強(qiáng)[3]，但其具體機(jī)制目前尚不明確。 表皮細(xì)胞的遷移過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞學(xué)行為，涉及表皮細(xì)胞與細(xì)胞外各種基質(zhì)的相互作用，包括細(xì)胞骨架的重組以及細(xì)胞的非對(duì)稱性分裂增殖（asymmetric divisions）等等[4]，在細(xì)胞遷移的每一個(gè)步驟當(dāng)中，都包含著細(xì)胞骨架特別是微管蛋白動(dòng)力學(xué)的變化[5]，需要進(jìn)行一系列的生化級(jí)聯(lián)反應(yīng)對(duì)微管蛋白動(dòng)力學(xué)來(lái)進(jìn)行調(diào)控，以便確保細(xì)胞在遷移速度和方向上的有效性及可控性。目前有研究已經(jīng)證實(shí)缺氧條件下可以調(diào)控微管動(dòng)力學(xué)[6]。所以，本研究就模擬人皮膚燒創(chuàng)傷后的局部缺氧微環(huán)境下，來(lái)觀察微管相關(guān)蛋白4(microtuble-associate protein4，MAP4)在人永生化表皮細(xì)胞（HaCaT細(xì)胞）中的表達(dá)變化和對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響，并試圖研究其機(jī)制。 我們?cè)谇捌谘芯炕A(chǔ)上，建立起了HaCaT細(xì)胞的缺氧模型，并采用體外細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Tanswell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、免疫共沉淀(immunoprecipitation，IP)、免疫熒光染色（immumofluorescence，IF）以及蛋白免疫印跡（western blot，WB）技術(shù)等實(shí)驗(yàn)方法來(lái)觀察HaCaT細(xì)胞在缺氧處理后細(xì)胞骨架蛋白的變化情況，MAP4在HaCaT細(xì)胞中的表達(dá)變化及其對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響，并研究MAP4與細(xì)胞動(dòng)力蛋白輕鏈1（Tctex-1）的關(guān)系及它們對(duì)HaCaT細(xì)胞遷移能力的影響。 研究方法 本研究共分為三部分： 第一部分：系統(tǒng)觀察缺氧微環(huán)境下HaCaT細(xì)胞遷移能力的變化及細(xì)胞微管動(dòng)力學(xué)的動(dòng)態(tài)變化 1.建立HaCaT細(xì)胞缺氧模型和培養(yǎng)方法：采用混合缺氧氣體預(yù)充方式（1%O2，94%N2，5%CO2），利用簡(jiǎn)易輸液袋密封后用真空泵抽氣后灌注混合氣體來(lái)進(jìn)行細(xì)胞缺氧處理及細(xì)胞培養(yǎng)，方法簡(jiǎn)便可行，細(xì)胞培養(yǎng)良好，無(wú)明顯不適現(xiàn)象。 2.設(shè)置細(xì)胞缺氧處理時(shí)間：24h，采用兩種體外細(xì)胞遷移模型（細(xì)胞體外劃痕實(shí)驗(yàn)和Tanswell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)）來(lái)觀察缺氧微環(huán)境下HaCaT細(xì)胞遷移能力的變化。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用單因素方差分析,兩兩比較行t檢驗(yàn)，以P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異，P＞0.05為差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)意義。 3.設(shè)置3個(gè)不同的細(xì)胞缺氧時(shí)間點(diǎn)：0.5h、1h及3h，采用IF實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察HaCaT細(xì)胞骨架蛋白的主要成分α-微管蛋白（α-tubulin）的變化來(lái)觀察細(xì)胞微管動(dòng)力學(xué)的動(dòng)態(tài)變化。 第二部分：缺氧微環(huán)境下MAP4對(duì)微管動(dòng)力學(xué)的調(diào)控及HaCaT細(xì)胞遷移能力的影響 1.設(shè)置4個(gè)不同的細(xì)胞缺氧時(shí)間點(diǎn)：0.5h、1h、3h及24h，采用WB實(shí)驗(yàn)觀察缺氧微環(huán)境下MAP4及磷酸化MAP4（p-MAP4）在HaCaT細(xì)胞中的表達(dá)變化。 2.構(gòu)建MAP4的高、低表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞，通過(guò)篩選建立穩(wěn)定的MAP4高、低表達(dá)的HaCaT細(xì)胞模型，采用細(xì)胞體外劃痕實(shí)驗(yàn)、Tanswell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)及IF實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察缺氧微環(huán)境下該細(xì)胞模型遷移能力的變化以及細(xì)胞微管動(dòng)力學(xué)的動(dòng)態(tài)變化。細(xì)胞缺氧處理時(shí)間同上，實(shí)驗(yàn)分組為：正常HaCaT組、高表達(dá)MAP4組、低表達(dá)MAP4組。 第三部分：缺氧微環(huán)境下Tctex-1與MAP4的作用關(guān)系及對(duì)HaCaT細(xì)胞微管動(dòng)力學(xué)的調(diào)控和細(xì)胞遷移能力的影響 1.設(shè)置4個(gè)不同的細(xì)胞缺氧時(shí)間點(diǎn)：0.5h、1h、3h及24h，采用WB實(shí)驗(yàn)觀察缺氧微環(huán)境下正常HaCaT組和高、低表達(dá)MAP4組中MAP4、p-MAP4及Tctex-1的表達(dá)變化。 2.構(gòu)建Tctex-1的高、低表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞，通過(guò)篩選建立穩(wěn)定Tctex-1高、低表達(dá)的HaCaT細(xì)胞模型，采用WB實(shí)驗(yàn)觀察缺氧微環(huán)境下Tctex-1高、低表達(dá)細(xì)胞模型中MAP4、p-MAP4及Tctex-1的表達(dá)變化，細(xì)胞缺氧時(shí)間點(diǎn)同上。 3.采用細(xì)胞體外劃痕實(shí)驗(yàn)、Tanswell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)及IF實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察缺氧微環(huán)境下Tctex-1的高、低表達(dá)細(xì)胞遷移能力的變化以及細(xì)胞微管動(dòng)力學(xué)的動(dòng)態(tài)變化。細(xì)胞缺氧處理時(shí)間同上，實(shí)驗(yàn)分組為：正常HaCaT組、高表達(dá)Tctex-1組、低表達(dá)Tctex-1組。 研究結(jié)果 1.成功建立了HaCaT細(xì)胞缺氧模型和培養(yǎng)方法。 2.細(xì)胞體外劃痕實(shí)驗(yàn)和Tanswell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：缺氧處理后，增強(qiáng)了HaCaT細(xì)胞的遷移能力（P＜0.05）。 3. IF實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：早期缺氧處理后，HaCaT細(xì)胞的骨架蛋白α-tubulin開(kāi)始解聚向胞體周緣聚集，細(xì)胞骨架變得疏松，細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始呈現(xiàn)多形性，細(xì)胞變得不穩(wěn)定。 4.缺氧處理后，WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：早期缺氧后（0.5h-1h），HaCaT細(xì)胞中MAP4和p-MAP4的表達(dá)會(huì)有短暫性的提高，隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)（3h-24h），MAP4和p-MAP4的表達(dá)會(huì)迅速降低（P＜0.05）。 5.成功建立了MAP4高、低表達(dá)的HaCaT細(xì)胞模型，細(xì)胞體外劃痕實(shí)驗(yàn)和Tanswell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與正常HaCaT組相比，低表達(dá)MAP4組細(xì)胞遷移能力明顯受到抑制，缺氧處理后（24h）亦無(wú)明顯提高。而高表達(dá)MAP4組細(xì)胞遷移能力在缺氧后增加明顯（P＜0.05），高、低表達(dá)對(duì)照組無(wú)明顯變化。IF實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與正常HaCaT組相比，缺氧后低表達(dá)MAP4組細(xì)胞形態(tài)皺縮，，骨架蛋白α-tubulin解聚不明顯，無(wú)邊集化現(xiàn)象，細(xì)胞遷移傾向不明顯。高表達(dá)MAP4組細(xì)胞在缺氧時(shí)間延長(zhǎng)后細(xì)胞骨架蛋白α-tubulin變化趨勢(shì)與正常HaCaT組相似。 6.缺氧處理后，與正常HaCaT組相比，高表達(dá)MAP4組細(xì)胞中MAP4和p-MAP4的表達(dá)明顯增加，變化趨勢(shì)相同，低表達(dá)MAP4組中MAP4和p-MAP4的表達(dá)明顯降低。Tctex-1的表達(dá)在早期缺氧后會(huì)短暫降低（0.5h），隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)增加（P＜0.05），呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，且高表達(dá)MAP4組會(huì)增加Tctex-1的表達(dá)，相應(yīng)的低表達(dá)MAP4組會(huì)降低Tctex-1的表達(dá)的表達(dá)。 7.成功建立了Tctex-1高、低表達(dá)的HaCaT細(xì)胞模型。兩種細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與正常HaCaT組相比，低表達(dá)Tctex-1組細(xì)胞遷移能力明顯受到抑制，而高表達(dá)Tctex-1組細(xì)胞遷移能力增加明顯（P＜0.05），高、低表達(dá)對(duì)照組無(wú)明顯變化。IF實(shí)驗(yàn)結(jié)果與高、低表達(dá)MAP4組細(xì)胞相似，高表達(dá)Tctex-1組細(xì)胞在缺氧后（24h）細(xì)胞骨架蛋白α-tubulin解聚明顯，出現(xiàn)邊集化現(xiàn)象，細(xì)胞骨架疏松，細(xì)胞呈現(xiàn)多形性，變得不穩(wěn)定而易于遷移。低表達(dá)Tctex-1組細(xì)胞皺縮，骨架蛋白解聚不明顯，無(wú)邊集化現(xiàn)象，缺氧后亦無(wú)明顯改變。 8. WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到：缺氧處理后（時(shí)間點(diǎn)同上），高、低表達(dá)Tctex-1組中MAP4、p-MAP4和Tctex-1的表達(dá)變化趨勢(shì)同高、低表達(dá)MAP4組，且高表達(dá)Tctex-1組可以提高M(jìn)AP4的表達(dá)，相應(yīng)的低表達(dá)Tctex-1組亦可以降低MAP4的表達(dá)（P＜0.05），現(xiàn)象同上。 結(jié)論： 缺氧微環(huán)境下可以調(diào)控HaCaT細(xì)胞中MAP4和Tctex-1的表達(dá)及細(xì)胞微管動(dòng)力學(xué)的變化，使細(xì)胞的遷移能力得到增強(qiáng)，其作用機(jī)制可能是缺氧微環(huán)境調(diào)控了MAP4的表達(dá)或者活性，進(jìn)而影響Tctex-1在HaCaT細(xì)胞的表達(dá)發(fā)生變化，共同來(lái)調(diào)控細(xì)胞微管動(dòng)力學(xué)影響表皮細(xì)胞的遷移。
【關(guān)鍵詞】：缺氧 表皮細(xì)胞 遷移 微管相關(guān)蛋白4 Tctex-1
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R641
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-7
• Abstract7-11
• 摘要11-15
• 第一章 前言15-21
• 1.1 課題研究意義18-19
• 1.2 課題思路及研究?jī)?nèi)容19-21
• 第二章 系統(tǒng)觀察缺氧微環(huán)境下 HaCaT 細(xì)胞遷移能力的變化及細(xì)胞微管動(dòng)力學(xué)的動(dòng)態(tài)變化21-32
• 2.1 材料與方法21-27
• 2.2 結(jié)果27-30
• 2.3 討論30-31
• 2.4 小結(jié)31-32
• 第三章 缺氧微環(huán)境下 MAP4 對(duì)微管動(dòng)力學(xué)的調(diào)控及 HaCaT 細(xì)胞遷移能力的影響32-52
• 3.1 材料與方法32-43
• 3.2 結(jié)果43-49
• 3.3 討論49-51
• 3.4 小結(jié)51-52
• 第四章 缺氧微環(huán)境下 Tctex-1 與 MAP4 的作用關(guān)系及對(duì) HaCaT 細(xì)胞微管動(dòng)力學(xué)的調(diào)控和細(xì)胞遷移能力的影響52-72
• 4.1 材料與方法52-63
• 4.2 結(jié)果63-69
• 4.3 討論69-71
• 4.4 小結(jié)71-72
• 全文總結(jié)72-75
• 參考文獻(xiàn)75-79
• 文獻(xiàn)綜述 微管及微管相關(guān)蛋白與細(xì)胞遷移的研究進(jìn)展79-90
• 參考文獻(xiàn)85-90
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的文章90-91
• 致謝91

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本文編號(hào)：256598