發(fā)布時(shí)間：2019-10-24 19:59

【摘要】：研究背景和目的： 暴露在高溫環(huán)境下人體可出現(xiàn)一系列不適癥狀如熱痙攣、熱暈厥和熱衰竭,嚴(yán)重可導(dǎo)致中暑或重癥中暑的發(fā)生,直接威脅人們的生命。據(jù)統(tǒng)計(jì),在2003年夏季歐洲熱浪導(dǎo)致了45000人死亡,其中三分之一死亡直接原因?yàn)橹惺�。隨著全球變暖,以及熱浪襲擊頻率和強(qiáng)度的增加,其發(fā)病和死亡率仍呈繼續(xù)上升趨勢(shì)。目前對(duì)于中暑病理過程中,導(dǎo)致組織和細(xì)胞損傷的機(jī)理尚不清楚,因此缺乏特殊有效的臨床早期診斷及治療措施,這也是重癥中暑患者高死亡率和致殘率的重要原因。在中暑發(fā)病過程中,熱是最根本的致傷原因。多項(xiàng)動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)高熱可直接誘導(dǎo)組織損傷和細(xì)胞死亡,根據(jù)遭受熱打擊的程度不同,細(xì)胞可激活凋亡信號(hào)或直接壞死。如組織細(xì)胞遭受極限溫度(49℃～50℃)打擊情況下,可在5分鐘內(nèi)直接導(dǎo)致細(xì)胞壞死；而一般高熱打擊大多是激活了細(xì)胞凋亡信號(hào),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此對(duì)于中暑發(fā)病過程中組織細(xì)胞的損傷形式目前一般認(rèn)為以凋亡為主。近年來針對(duì)熱應(yīng)激分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn),熱在廣闊的范圍內(nèi)調(diào)節(jié)著細(xì)胞各項(xiàng)生理活動(dòng),參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。包括：調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白caspase的活化,介導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)程；通過熱打擊過程中產(chǎn)生的各種氧代謝產(chǎn)物、蛋白酶類、細(xì)胞因子等作為信號(hào)分子抑制或激活多條信號(hào)傳導(dǎo)通路介導(dǎo)細(xì)胞存活或死亡,如活性氧(reactive oxygen species, ROS)的大量產(chǎn)生在熱打擊誘導(dǎo)組織細(xì)胞損傷中的作用已逐漸引起人們的關(guān)注；通過誘導(dǎo)DNA損傷、p53活化等導(dǎo)致細(xì)胞增殖受抑,促進(jìn)細(xì)胞凋亡等。但是這些研究一方面在動(dòng)物模型上多限于凋亡表象的觀察,深入的機(jī)制研究還較少,針對(duì)于熱打擊誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的精確機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。另外一方面在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)上多集中于腫瘤細(xì)胞株的研究,針對(duì)于正常組織細(xì)胞的研究較少,鑒于全球升溫,以及世界范圍內(nèi)熱浪強(qiáng)度和頻度的增加,由熱引起的疾病發(fā)病率和死亡率也在逐年攀升,因此高熱引起正常組織細(xì)胞損傷的研究迫切需要引起人們的重視。 血管內(nèi)皮細(xì)胞作為一個(gè)重要器官在熱損傷早期損害中占有重要地位,近年來研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、結(jié)構(gòu)受損在中暑臟器損害的發(fā)生發(fā)展中具有極其重要的作用,是導(dǎo)致重癥中暑多器官功能障礙(MODS)的重要原因。動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)已證實(shí)了高熱可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞廣泛凋亡。目前尚不清楚內(nèi)皮細(xì)胞凋亡在中暑發(fā)病過程中的具體作用,針對(duì)于熱打擊誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制國內(nèi)外也尚未見報(bào)道。我們前期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),重癥中暑患者存在嚴(yán)重的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,主要表現(xiàn)在外周血循環(huán)血管內(nèi)皮細(xì)胞(circulation endothelia cells,CEC)數(shù)量明顯升高,CEC是生理或病理情況下從循環(huán)中脫落的血管內(nèi)皮細(xì)胞,是目前唯一能夠在活體持續(xù)檢測(cè)到的可特異性、直接反映活體毛細(xì)血管損傷程度的指標(biāo)。進(jìn)一步體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),熱打擊對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有直接細(xì)胞毒效應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞增殖受抑。但是對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞遭受熱打擊后細(xì)胞的表現(xiàn)形式、細(xì)胞損傷機(jī)制等仍有待進(jìn)一步闡明。 基于前期研究結(jié)果,本研究目的在于探討熱打擊誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制,闡明介導(dǎo)熱打擊誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路、上游信號(hào)分子以及中間環(huán)節(jié)各信號(hào)分子之間的相互作用,從分子水平上了解熱打擊誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡機(jī)制,為揭示中暑內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的病理過程奠定基礎(chǔ),也為臨床中暑預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。 主要方法和結(jié)果： 1.熱打擊對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)細(xì)胞具有直接細(xì)胞毒效應(yīng),誘導(dǎo)了細(xì)胞早期凋亡 收集熱打擊(43℃,2h)后不同復(fù)溫時(shí)間點(diǎn)(0、1、3、6、9h)及37℃對(duì)照組細(xì)胞,使用乳酸脫氫酶(LDH)法和水溶性四唑鹽(WST-1)法檢測(cè)熱打擊對(duì)細(xì)胞的損傷,評(píng)價(jià)熱的細(xì)胞毒效應(yīng)。Annexin V/PI染色,并用流式細(xì)胞儀觀察熱打擊后細(xì)胞凋亡。熱打擊對(duì)細(xì)胞的損傷作用在早期即出現(xiàn)：復(fù)溫0小時(shí)開始細(xì)胞損傷隨復(fù)溫時(shí)間的延長而加重(F:109.459,P：0.001)。細(xì)胞凋亡由對(duì)照組4.4%在復(fù)溫后3小時(shí)左右明顯增加到12%,而復(fù)溫6小時(shí)細(xì)胞凋亡近30%(F：959.117,P：0.001)。 2.熱打擊激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的UPR反應(yīng)但沒有啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑,而是啟動(dòng)了線粒體凋亡途徑 提取熱打擊后不同復(fù)溫時(shí)間點(diǎn)(0、1、3、6、9h)和37℃對(duì)照組的HUVEC細(xì)胞總蛋白,Western blot方法分析UPR反應(yīng)相關(guān)蛋白p-PERK、P-eIF2a、ATF4、 XBP-1s、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78以及ER凋亡相關(guān)蛋白GADD153的表達(dá)。RT-PCR方法檢測(cè)熱打擊后不同時(shí)間點(diǎn)EDEM基因的轉(zhuǎn)錄。結(jié)果發(fā)習(xí)PERK在熱打擊復(fù)溫Oh左右即被自我磷酸化而激活,隨后其激活被逐漸抑制。eIF2a的磷酸化激活發(fā)生在熱打擊復(fù)溫1h左右,稍晚于PERK的激活,其活化在1h左右即達(dá)到高峰,隨著復(fù)溫時(shí)間的延長開始逐漸下降。ATF4在3h左右表達(dá)增強(qiáng),6h表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng),9h表達(dá)明顯被抑制。ATF6在熱打擊后復(fù)溫0h左右表達(dá)最強(qiáng)隨后降低,在3h左右回復(fù)到基線水平。XBP-1s的表達(dá)在1h左右增加,在3h達(dá)高峰,隨后也逐漸降低,EDEM基因的轉(zhuǎn)錄檢測(cè)顯示與XBP-1s蛋白的激活誘導(dǎo)相一致；GRP78在熱打擊0h被激活,持續(xù)到熱打擊后3h左右,其后激活狀態(tài)逐漸被抑制；而熱打擊沒有明顯促進(jìn)GADD153的表達(dá)。以上結(jié)果說明了熱打擊在作用的早期明顯誘導(dǎo)了UPR三條信號(hào)通路的激活,即ERK-eIF2a-ATF4, IRE1-XBP-1S和ATF6,而隨著復(fù)溫時(shí)間的延長,UPR的激活逐漸被抑制,但熱打擊沒有激活ER應(yīng)激凋亡途徑。 利用caspase活性檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)熱打擊細(xì)胞caspase-9、-8、-4、-3的活化。熒光分光光度計(jì)檢測(cè)經(jīng)JC-1標(biāo)記的熱打擊細(xì)胞。并分別提取線粒體和細(xì)胞質(zhì)蛋白,Western blot方法分析熱打擊細(xì)胞的細(xì)胞色素c的亞細(xì)胞表達(dá)。發(fā)現(xiàn)熱打擊后細(xì)胞caspase-9、-3在3h左右活化,6h達(dá)到最高值,9h后稍有降低(caspase-9F:47.903, P：0.001; caspase-3F：65.602, P：0.001);沒有檢測(cè)到熱打擊后caspase-4、-8的活化(caspase-4F：2.146, P:0.149; caspase-8F:0.604, P：0.669);熱打擊后3、6、9h也檢測(cè)到了線粒體膜電位呈復(fù)溫時(shí)間依賴性明顯下降,細(xì)胞色素c的釋放與線粒體膜電位下降趨勢(shì)一致。以上結(jié)果表明熱打擊主要啟動(dòng)了線粒體凋亡途徑。 3.熱打擊誘導(dǎo)了p53轉(zhuǎn)錄非依賴介導(dǎo)的線粒體凋亡通路 使用p53-siRNA降低細(xì)胞p53蛋白的表達(dá),熱打擊p53-siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。結(jié)果顯示p53-siRNA明顯降低了熱打擊誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,同時(shí)也部分抑制了熱打擊誘導(dǎo)的細(xì)胞色素c的釋放、線粒體膜電位的下降以及aspase-9的活化。分別提取線粒體和細(xì)胞質(zhì)蛋白,Western blot方法分析熱打擊后p53蛋白的亞細(xì)胞表達(dá),激光共聚焦觀察p53蛋白亞細(xì)胞定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)熱打擊誘導(dǎo)了p53蛋白轉(zhuǎn)位到線粒體。進(jìn)一步使用PFT預(yù)處理細(xì)胞,結(jié)果顯示PFT明顯抑制了熱打擊誘導(dǎo)的p53蛋白線粒體轉(zhuǎn)位,同時(shí)也抑制了細(xì)胞色素c的釋放、線粒體膜電位的下降以及caspase-9的活化(caspase-9F:11.810, P：0.001;"喀穖F:13.202, P:0.0001)。這一結(jié)果說明了熱打擊引起p53轉(zhuǎn)位到線粒體,進(jìn)而啟動(dòng)了線粒體凋亡通路。 4.熱打擊誘導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)Ca2+失穩(wěn)激活MPTP開放介導(dǎo)的線粒體凋亡通路 使用Ca2+敏感的熒光染料Flou-3AM標(biāo)記胞質(zhì)Ca2+,流式細(xì)胞儀分析熱打擊復(fù)溫各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平。同時(shí)用Flou-3AM綠色熒光標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)Ca2+,Mito tracker紅色熒光標(biāo)記線粒體,激光共聚焦顯微鏡觀察熱打擊后細(xì)胞內(nèi)Ca2+的分布。結(jié)果顯示熱打擊在0h導(dǎo)致胞質(zhì)Ca2+水平升高,1h達(dá)到高峰,其后逐漸降低。激光共聚焦分別觀察對(duì)照組、熱打擊后復(fù)溫1h、熱打擊后復(fù)溫6h的熒光分布,發(fā)現(xiàn)熱打擊后復(fù)溫1h標(biāo)記Ca2+綠色熒光和標(biāo)記線粒體的紅色熒光部分重疊呈橙色,復(fù)溫6h大部分綠色熒光和紅色熒光重疊為橙色,表明熱打擊后胞質(zhì)內(nèi)Ca2+大部分被線粒體吸收,可能導(dǎo)致線粒體鈣超載。我們進(jìn)一步分析了Ca2+下游的兩個(gè)標(biāo)靶線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)和鈣蛋白酶(calpain)的活化。使用酯化鈣黃綠素(Calcei n-AM)和氯化鈷(CoC12)共孵育的方法檢測(cè)MPTP開放。Calpain活性檢測(cè)試劑盒分析Calpain的活化。熱打擊后1h左右觀察到明顯的MPTP開放,表現(xiàn)為線粒體熒光強(qiáng)度隨著復(fù)溫時(shí)間的延長而逐漸減弱(F：40.293,P：0.001),而Calpain沒有被熱打擊活化。并且,Ca2+螯合齊BAPTA-AM完全阻滯了熱打擊復(fù)溫1h的MPTP開放。利用特異性MPTP抑制劑環(huán)孢素A(cyclosporin A,CsA)預(yù)處理細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)CsA部分抑制了熱打擊誘導(dǎo)的細(xì)胞色素c的釋放、線粒體膜電位下降以及caspase-9的活化,與未使用CsA處理組相比差異明顯(caspase-9F:4.958, P：0.008;"喀穖F:3.668, P：0.021)。表明了MTTP開放參與了熱打擊誘導(dǎo)線粒體凋亡通路的激活。 5. Bax構(gòu)象改變和線粒體轉(zhuǎn)位介導(dǎo)了熱打擊誘導(dǎo)的線粒體凋亡通路 收集熱打擊后不同復(fù)溫時(shí)間點(diǎn)及對(duì)照組細(xì)胞,提取線粒體和細(xì)胞質(zhì)蛋白,Westren blot分析Bax蛋白的亞細(xì)胞表達(dá),同時(shí)用pEGFP-C3-Bax質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞(GFP-Bax細(xì)胞),激光共聚焦顯微鏡觀察熱打擊凋亡細(xì)胞GFP-Bax蛋白亞細(xì)胞分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)熱打擊復(fù)溫3h左右細(xì)胞質(zhì)中的Bax蛋白表達(dá)隨著復(fù)溫時(shí)間而逐漸減少,而線粒體中Bax蛋白表達(dá)相應(yīng)的逐漸增多,熱打擊后GFP-Bax蛋白的綠色熒光與Mito tracker標(biāo)記的紅色熒光大部分重疊呈橙色。進(jìn)一步收集熱打擊后復(fù)溫0、1、3、6、9h和對(duì)照組的HUVEC細(xì)胞,然后用抗Bax6A7抗體把己發(fā)生構(gòu)象變化的Bax蛋白免疫沉淀下來用以Western blot分析,結(jié)果顯示對(duì)照組和熱打擊后0、1h組未檢測(cè)到發(fā)生構(gòu)象變化的Bax,而在3、6、9h可以檢測(cè)到發(fā)生構(gòu)象變化的Bax。利用Bax-siRNA方法降低細(xì)胞Bax的蛋白水平表達(dá),發(fā)現(xiàn)Bax-siRNA顯著抑制了細(xì)胞色素c的釋放、線粒體膜電位下降以及caspase-9的活(caspase-9F:11.810, P:0.008;"喀穖F:7.878, P:0.021)。 6.熱打擊引起P53線粒體轉(zhuǎn)位和MPTP開放共同介導(dǎo)了Bax構(gòu)象改變和線粒體轉(zhuǎn)位 熱打擊PFT和CsA預(yù)處理的HUVEC細(xì)胞,在熱打擊后復(fù)溫6h收集細(xì)胞,分別提取線粒體蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白,Westren blot分析Bax蛋白的亞細(xì)胞表達(dá)。進(jìn)一步用抗Bax6A7抗體免疫沉淀發(fā)生構(gòu)象改變的Bax蛋白,Westren blot分析構(gòu)象改變Bax蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示PFT和CsA均有效抑制了熱打擊誘導(dǎo)的Bax構(gòu)陷改變和線粒體轉(zhuǎn)位。說明p53線粒體轉(zhuǎn)位和MPTP開放共同介導(dǎo)了熱打擊誘導(dǎo)的Bax構(gòu)象改變和線粒體移位。 7.熱打擊引起ROS產(chǎn)生介導(dǎo)了P53線粒體轉(zhuǎn)位和Ca2+失穩(wěn),以及下游線粒體凋亡通路的活化 收集熱打擊后不同復(fù)溫時(shí)間點(diǎn)(0、0.5、1、3、6、9h)和37℃對(duì)照組的HUVEC細(xì)胞,分別使用了熒光探針DHE、DHR和DAF-FMDA標(biāo)記細(xì)胞,流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)熱打擊后02-、H202和NO在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。熱打擊主要誘導(dǎo)了02-和H202這兩種自由基的升高(O2-F:225.788, P:0.008; H2O2F：256.770,P：0.021),而對(duì)NO沒有明顯的影響(F:2.000, P：0.134).02-和H202的升高趨勢(shì)不完全一致,熱打擊后Oh02-即顯著升高,而H202在0h改變不明顯,在0.5h開始明顯升高,02-和H202的升高趨勢(shì)均呈復(fù)溫時(shí)間依賴性。 MnTBAP、PFT以及BAPTA-AM預(yù)處理細(xì)胞,43℃熱打擊細(xì)胞2h,繼續(xù)在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育0h或6h,收集細(xì)胞。結(jié)果顯示MnTBAP完全抑制了熱打擊復(fù)溫Oh p53的線粒體轉(zhuǎn)位和細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平升高,同時(shí)MnTBAP也顯著抑制了熱打擊誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、Bax蛋白構(gòu)象改變和線粒體轉(zhuǎn)位以及下游的細(xì)胞色素c釋放、線粒體膜電位降低和caspase-9的活化(caspase-9F:6.386, P:0.003;"喀穖 F:6.827, P:0.002)。而PFT以及BAPTA-AM對(duì)熱打擊復(fù)溫0h的ROS沒有影響。 結(jié)論： 1.熱打擊激活了ER激UPR反應(yīng)的三條信號(hào)通路：PERK-eIF2a-ATF4、 IRE1-XBP-1S、ATF6,但是沒有激活ER應(yīng)激凋亡途徑,而是通過激活線粒體凋亡途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 2.p53在熱打擊誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起著重要的作用,并以轉(zhuǎn)錄非依賴的方式參與介導(dǎo)了線粒體凋亡途徑。 3.細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平失穩(wěn)也在熱打擊誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要的作用,熱打擊首先迅速誘導(dǎo)胞質(zhì)鈣離子升高,繼而線粒體超載,在這一過程中激活了MPTP開放,從而啟動(dòng)線粒體凋亡途徑。 4.Bax蛋白是熱打擊誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中的中間環(huán)節(jié),p53轉(zhuǎn)錄非依賴方式和Ca2+失穩(wěn)激活的MPTP開放通過誘導(dǎo)Bax蛋白構(gòu)象改變和線粒體轉(zhuǎn)位啟動(dòng)線粒體凋亡途徑。 5.熱打擊誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的ROS是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡途徑的上游信號(hào)分子,分別激活了p53線粒體轉(zhuǎn)位和細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平失穩(wěn),從而介導(dǎo)下游線粒體凋亡通路。
【圖文】：

三條凋亡信號(hào)通路圖通過剪切激活不同的caspase介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[33]

圖1-2 ER應(yīng)激誘導(dǎo)的UPR反應(yīng)信號(hào)通路[46>Figure 1-2 ER stress activates the unfolded protein response (UPR)3.3活性氧與細(xì)胞調(diào)亡活性氧(reactive oxygen species, ROS)是指化學(xué)性質(zhì)更為活躍的氧代謝產(chǎn)物或由其衍生的含氧產(chǎn)物，由于具有比0更強(qiáng)的反應(yīng)性而得名，主要包括:過氧化氧(H2O2)、超氧化物陰離子((V)、一氧化氮（NO)等[51]。ROS以其高反應(yīng)性在生命活動(dòng)中扮演了非常重要的角色。ROS的氧化作用是非特異的，機(jī)體內(nèi)有一套反饋機(jī)制調(diào)節(jié)著ROS的產(chǎn)生和清除，使其穩(wěn)定于適宜的水平。ROS被發(fā)現(xiàn)廣泛的參與了胞內(nèi)信號(hào)傳遞，調(diào)控細(xì)胞對(duì)外界刺激反的應(yīng)，決定細(xì)胞的命運(yùn)[51]。ROS水平的失衡可以導(dǎo)致細(xì)胞器損傷，損傷后的細(xì)胞器通過自吞噬作用清除，或者引起細(xì)胞調(diào)亡。目前過量ROS已被公認(rèn)為是誘導(dǎo)凋亡的介質(zhì)。其機(jī)制和特點(diǎn)如下[52-55]: ROS可引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，，從而誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡。并且脂質(zhì)過
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R594.12

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2552687